阿维菌素高产菌的筛选及阿维聚酮体合成酶基因的改造

来源 :沈阳药科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:furong2599
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以野生型阿维链霉菌Streptomyces avermitilis K310为出发菌株,研究并确定了菌株的各项基本发酵参数。通过NTG和HNO2对菌株进行多次的循环诱变,通过大量的筛选选育高产菌株,结合均匀设计优化阿维链霉菌的发酵培养基配方,最终选育得到了高产菌株S.avermitilis SY311,其40ml摇瓶发酵总效价接近4500μg/ml,有效组分B1a的效价为1500μg/ml,相对于原始出发菌株的发酵总效价不到100μg/ml有了很大的提高,达到了预期的试验目的。 以烯酰基还原酶(enoylreductase,ER)中高度保守的序列作为ER的基因的引物,从质粒(22)g-8-E-10中得到可能含有milbemycin PKS modular2 DH2-ER2的基因的片段milDH2-ER2,基因测序后进行Frameplot分析和BLASTp同源性分析,并用生物信息学的一些方法最终获得了完整的milbemycin PKS modular2 DH2-ER2的基因,GenBank收录号为AY396043。 利用组合生物学的原理,改造阿维菌素产生菌的聚酮体合成酶。构建杂合的PKS modular2基因,基因重组后希望得到能直接产生新的抗生素—Ivermectin的工程菌。通过PCR的方法,分别扩增得到了2.6kb含有milbemycin PKS modular2 DH2-ER2的基因片段和3.6kb含有avermectin PKS modular2 AT-DH-KR的基因片段,酶切分析和序列测定均正确。通过选择合适的酶切位点,将这两个模块基因进行组合,最终构建了含有杂合PKS modular2的温敏性接合转移质粒pHZAM311。正在通过接合转移的方法往S.avermitilis SY311中转化,并通过一次、二次同源交换得到基因重组菌。
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