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第一部分PI3K/AKT信号传导通路蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义目的：探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其临床意义。方法：回顾性分析157例NSCLC患者的临床资料，其中鳞癌75例，腺癌82例，Ⅰ-ⅢA期70例，ⅢB-Ⅳ期87例，并收集30例手术切除肺癌癌旁组织标本。应用免疫组织化学方法检测PI3K和p-AKT蛋白在NSCLC癌组织和手术切除的肺癌癌旁组织中的表达，分析PI3K和p-AKT蛋白表达与NSCLC患者临床资料变量的关系，同时分析PI3K和p-AKT蛋白表达与ⅢB-Ⅳ期NSCLC预后的关系。结果：PI3K和p-AKT在Ⅰ-ⅢA期NSCLC中的表达明显高于癌旁组织（χ2=14.8455，P=0.000；χ2=14.2615，P=0.000）。p-AKT表达与Ⅰ-ⅢA期NSCLC的淋巴结转移、TNM分期呈正相关(χ2=6.1189,P=0.013，χ2=8.9752,P=0.011)，而与肿瘤的性别、年龄、病理类型、分化程度无关。p-AKT表达与ⅢB-Ⅳ期NSCLC的TNM分期呈正相关（χ2=5.7501,P=0.016），与肿瘤的性别、年龄、病理类型、分化程度、体力状态（PS）评分无关。PI3K表达与上述临床特征无关。在ⅢB-Ⅳ期NSCLC中，PI3K阴性表达组的中位数生存时间明显优于阳性表达组[17.699月(95%CI15.114-20.283)/13.426月(95%CI11.832-15.021)，P=0.004]，p-AKT阴性表达组的中位数生存时间明显亦优于阳性表达组[17.134月(95%CI14.927-19.341)/13.067月(95%CI11.316-14.817)，P=0.007]。多变量Cox’s回归分析显示PI3K [HR=2.143(95%CI1.211-3.790)，P=0.009]， p-AKT [HR=1.991(95%CI1.009-3.927)，P=0.047]，TNM分期[HR=4.788(95%CI2.591-8.848)， P=0.000]， PS评分[HR=3.272(95%CI1.701-6.296)，P=0.000]是ⅢB-Ⅳ期NSCLC的独立不利预后因素。结论： p-AKT与NSCLC不良预后因素密切相关， PI3K、p-AKT的高表达是晚期NSCLC预后的独立不利因素。第二部分人肺腺癌干细胞的分离、培养与鉴定目的：从人肺腺癌组织中分离、培养及鉴定具有干细胞特征的高致瘤性类肺癌干细胞。方法：采用磁性细胞分选(magnetic activated cell sorting，MACS)技术从人肺腺癌组织单细胞悬液中分离CD133阳性细胞，无血清培养基富集CD133阳性细胞，流式细胞仪及免疫荧光检测富集后细胞的CD133的表达，并通过NOD/SCID小鼠移植评估其致瘤性。结果：人肺腺癌组织CD133阳性细胞成功分离，无血清培养法可用于分离的CD133阳性细胞的培养及富集，其具有自我更新，多项分化及高致瘤能力，在NOD/SCID小鼠中仅需移植100个细胞即可形成肿瘤。结论：MACS联用无血清培养法是人类肺癌干细胞分离和富集的有效方法。第三部分SiRNA沉默AKTl、PI3K P85基因对肺癌干细胞增殖及自我更新的影响目的：探讨RNAi(RNA interference)技术下调肺癌干细胞中AKTl和PI3K P85亚基的表达对肺癌干细胞增殖和自我更新的影响。方法：实时荧光定量PCR检测肺癌干细胞中AKTl和PI3K P85mRNA的表达。将包含AKT1、PI3K P85两种siRNA开放阅读框的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒质粒表达载体rAd5-siAKTl-siPI3K P85转染至肺癌干细胞中。应用Western blotting检测转染后目的基因蛋白的表达水平，并用Western blotting检测目的基因被沉默后PCNA、cyclinD1和P53的表达情况。分别采用MTT增殖实验、细胞球形成实验和异种移植瘤形成实验观察各组差异，并用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。结果：肺癌干细胞AKT1和PI3K P85亚基的mRNA表达明显高于肺癌原代细胞，重组腺病毒质粒表达载体rAd5-siAKTl-siPI3K P85介导的靶向AKTl，PI3K P85shRNA可以有效下调目的基因AKT1和PI3K P85的蛋白表达；下游相关因子PCNA、cyclin D1的表达亦下调，P53表达则上调。MTT增殖实验、细胞球形成实验和异种移植瘤形成实验发现肺癌干细胞增殖、自我更新、体外致瘤能力都显著降低。结论：AKTl和PI3K P85基因在肺癌干细胞高表达，靶向AKTl/PI3K P85亚基的shRNA技术可以抑制肺癌干细胞中AKTl、PI3K P85亚基的表达，抑制肺癌干细胞的体外增殖及自我更新能力。