抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾类钙粘蛋白基因片段表达及增效作用研究

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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)由于能够产生多种对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫具有较好的杀虫活性的晶体蛋白而被作为杀虫剂广泛的应用于世界各地。小菜蛾Plutella xylostella(L.)属于鳞翅目害虫,是最早发现的对Bt产生抗药性的田间种群,广泛的分布于世界各地。为了更好的研究小菜蛾的Bt抗性遗传机理和分子机理,本研究利用高世代回交法和双亲嵌合背景法建立了小菜蛾近等基因系种群RIL-S6,RIL-R6,BC6F4,经ISSR种群相似度鉴定,各种群相似度达0.8以上。利用PCR的方法,合成3对引物扩增出小菜蛾类钙粘蛋白3个基因片段,经过连接、转化构建阳性克隆载体。经过PCR验证、质粒单酶切双酶切、测序成功构建出了三个融合表达载体分别命名为pET-28a-cadI、pET-28a-cadII、pET-28a-cadIII。对构建好的融合表达载体进行IPTG浓度诱导、时间诱导、温度诱导的表达条件优化,经SDS-PAGE凝胶电泳可知:蛋白表达量最高的诱导条件为25℃,0.1mM/LIPTG浓度诱导36h。将在不同温度条件下表达的融合蛋白菌体破碎后的蛋白上清和沉淀SDS-PAGE凝胶电泳可知:在不同的温度下融合蛋白均以包涵体的形式存在。对表达的粗蛋白进行生物活性测定结果发现:三个片段表达的融合蛋白和2μg/μlCry1Ac毒素混合的杀虫活性与单独的三个片段表达的融合蛋白和单独的2μg/μlCry1Ac毒素的杀虫活性相比明显的提高,这样的结果表明小菜蛾类钙粘蛋白连接区域的片段对于Cry1Ac毒素对小菜蛾的杀虫活性有增效作用。
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