血管性痴呆(vascular dementia，VaD)是指各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征。VaD以学习、记忆功能损害为主要症状，可伴有运动、语言、视空间及人格障碍。随着社会人口日益老龄化和脑卒中后生存率的提高，由脑卒中造成的精神及智能损害日益突出，给社会和家庭带来沉重负担。脑卒中后缺血-再灌注是诱发VaD的主要原因之一。脑缺血可以诱导脑梗死或选择性脑神经元死亡，当缺血发生在与学习、记忆密切相关的区域时，即可导致VaD的发生。海马是学习记忆的关键部位，同时又是缺血缺氧的敏感部位。但导致海马CA1区神经细胞死亡的调控机制目前不祥。细胞的死亡方式有2种：细胞坏死和程序性细胞死亡，其中程序性细胞死亡有Ⅰ型(细胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性细胞死亡)两种。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt, phosphoinositide3kinase/Akt)信号转导途径是一个经典抗凋亡、促存活的信号转导途径。它的激活在神经细胞，尤其在缺血缺氧神经元损伤中起着重要作用，并逐渐受到广泛重视。近年来发现其与自噬的调节密切相关。PI3K/Akt信号转导通路在脑缺血和神经退行性变中的作用已被广泛研究，已有研究发现PI3K/Akt信号转导通路与学习认知有关。但PI3K/Akt信号转导通路在VaD发病机制中的作用尚不清楚。因此，研究PI3K/Akt信号通路与VaD的关系，对于VaD的基础及临床研究，具有重要的指导意义。丁苯酞(3-n-butylphthalide，NBP)是中国医学科学院药物研究所研制开发的一类新型抗脑缺血药物，对急性缺血性脑卒中有明显疗效。既往研究发现丁苯酞具有多靶点抗脑缺血作用，能改善缺血区局部脑血流，缩小脑梗死面积，改善线粒体功能，抑制自由基的产生，抑制炎症反应，抑制谷氨酸释放，减轻脑缺血所致脑水肿，抗血栓形成和抗血小板聚集，并且有研究证实能抑制神经细胞凋亡，保护缺血缺氧引起的神经细胞损伤，神经功能缺失及脑缺血记忆障碍。而这些机制均与血管性痴呆的发生有关。近年来，左旋丁苯酞(l-NBP)和右旋丁苯酞(d-NBP)已经被拆分，并且将拆分后的l-NBP和d-NBP进行了对比研究后发现，l-NBP比d-NBP的作用更强，而且还发现在对神经细胞凋亡研究中d-NBP的存在降低了dl-NBP的作用，从而证明d-NBP有拮抗l-NBP作用，因而开发l-NBP的意义更为重。目前该药应用于VaD的实验研究少有报道，更无其与PI3K/Akt信号转导通路之间关系的报道。基于此，本文拟通过观察PI3K/Akt信号转导通路在VaD小鼠海马组织中的变化，以及l-NBP对VaD的影响，以探讨PI3K/Akt信号转导通路在VaD的发病机制中的作用及l-NBP的作用机制。第一部分：血管性痴呆小鼠模型的建立和左旋丁苯酞的防治作用目的：观察脑反复缺血再灌注后C57BL/6小鼠行为学的改变和海马病理学特征变化，并观察l-NBP对脑反复缺血再灌注诱导的VaD小鼠空间学习记忆障碍的影响。方法：将C57BL/6小鼠随机分为假手术组（sham组）、模型组（IR组，造模后植物油灌胃6ml.kg-1.d-1，连续28天）、左旋丁苯酞预防性治疗组（Pre-l-NBP组，造模前7天左旋-丁苯酞灌胃30mg.kg-1.d-1，连续7天）、左旋丁苯酞低剂量治疗组（Low-l-NBP组，造模后左旋-丁苯酞灌胃30mg.kg-1.d-1，连续28天)和左旋丁苯酞高剂量治疗组（High-l-NBP组，造模后左旋-丁苯酞灌胃60mg.kg-1.d-1，连续28天）；除假手术组外均给予双侧颈总动脉反复三次缺血-再灌注方法建立小鼠VaD模型，假手术组仅暴露颈总动脉不结扎。造模4周后通过Morris水迷宫试验和跳台试验进行学习和记忆成绩测试，观察其行为学改变；应用琉堇染色观察海马病理学特征变化。结果：1空间学习记忆能力的改变——Morris水迷宫实验在定位航行实验中，IR组小鼠的寻台潜伏期明显长于Sham组小鼠[F(1,27)=30.09，p<0.01]。l-NBP各组小鼠寻台潜伏期与IR组小鼠相比明显缩短[F(3,50)=10.315，P<0.01]。在实验的第2-5天，sham组小鼠、Pre-l-NBP组小鼠寻台潜伏期明显短于IR组小鼠（P<0.05, P<0.01）；在实验的第3-5天，Low-l-NBP组和High-l-NBP组小鼠寻台潜伏期明显短于IR组小鼠（P<0.05，P<0.01）。在空间探索试验中，与IR组小鼠相比，Sham组小鼠对目标象限表现出明显的偏爱（P<0.01)。与IR组小鼠相比，High-l-NBP和Pre-l-NBP组小鼠对目标象限表现出明显的偏爱(P<0.05, P<0.01)。2被动逃避反应的改变——跳台实验2.1下台潜伏时间：IR组与Sham组相比小鼠的首次跳下平台的潜伏时间明显缩短(P<0.01)，提示小鼠记忆形成功能受损；Low-l-NBP组、High-l-NBP组和Pre-l-NBP组与IR组相比跳下平台的潜伏时间明显增加(P<0.05)，提示l-NBP可改善小鼠记忆形成功能。2.2错误次数：IR组与Sham组相比小鼠跳下平台的错误次数明显增多(P<0.05)，Low-l-NBP组、High-l-NBP组和Pre-l-NBP组与IR组相比跳下平台的错误次数明显减少，但无统计学意义(P>0.05)。3小鼠海马的组织病理学改变硫堇染色显示，sham组小鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐、致密，细胞形态完整，胞核饱满，核仁清晰。IR组小鼠海马CA1区可见片段性的锥体细胞缺失，部分细胞形态发生明显改变，可见胞体缩小，形态不规则，呈梭型或多角形，胞核固缩、浓染，核仁模糊不清或消失。与IR组相比，Low-l-NBP组、High-l-NBP组和Pre-l-NBP组小鼠海马CA1区的锥体细胞缺失明显减轻。结论：1本实验通过双侧颈总动脉反复三次缺血-再灌注方法成功的建立了C57BL/6小鼠VaD模型。预防性和治疗性应用l-NBP可以减轻VaD小鼠学习和记忆障碍，尤以预防性应用l-NBP效果显著。2反复缺血再灌注4周后小鼠海马组织CA1区出现神经细胞片段性缺失、排列紊乱、神经元密度降低等改变。预防性和治疗性应用l-NBP可以减轻VaD小鼠海马组织病理学变化，进而改善其学习和记忆能力。第二部分：PI3K激动剂及抑制剂对血管性痴呆小鼠认知功能的影响目的：观察PI3K激动剂及抑制剂对VaD小鼠认知功能的影响。方法：将C57BL/6小鼠随机分为假手术组（sham组）、激动剂组(IR+IGF-1组，手术前及手术24小时后经侧脑室给予IGF-12ul/mouse)、激动剂溶剂对照组(IR+DW组，手术前及手术24小时后经侧脑室给予去离子水2μl/mouse)、抑制剂组(IR+LY294002组，手术前及手术24小时后经侧脑室给予LY29400210nmol/mouse)和抑制剂溶剂对照组(IR+DMSO组，手术前及手术24小时后经侧脑室给予同等体积(2μl)的溶剂)；除假手术组外均给予双侧颈总动脉反复三次缺血-再灌注方法建立小鼠VaD模型，侧脑室插管给予相应试剂；假手术组仅暴露颈总动脉不结扎。造模4周后通过Morris水迷宫试验进行学习和记忆成绩测试，观察其行为学改变；应用Western Blot方法测定各组小鼠海马组织中Akt及p-Akt Ser473蛋白的变化。结果：1空间学习记忆能力的改变——Morris水迷宫实验在定位航行实验中，Sham组和IR+IGF-1组小鼠的寻台潜伏期明显短于IR+DW组、IR+LY294002组、IR+DMSO组小鼠[F(4,45)=9.702，P<0.01]。在空间探索试验中，与IR+DW组、IR+LY294002组、IR+DMSO组小鼠相比，sham组和IR+IGF-1组小鼠对目标象限表现出明显的偏爱(P<0.01)。2Akt、pAkt Ser473在海马组织中表达的变化术后4周Sham组、IR+DW组、IR+IGF-1组、IR+DMSO组和IR+LY294002组之间Akt总蛋白表达无明显差异(P>0.05)；IR+DW组、IR+IGF-1组、IR+DMSO组和IR+LY294002组的p-Akt Ser473的蛋白表达明显高于sham组（P<0.01, P<0.05）。IR+IGF-1组p-Akt的蛋白表达明显高于IR+DW组、IR+DMSO组和IR+LY294002组（P<0.05）。IR+LY294002组p-Akt的蛋白表达低于IR+DMSO组（P<0.05）。结论：PI3K激动剂IGF-1可以减轻VaD小鼠学习记忆功能障碍，促进海马组织中p-Akt Ser473表达。其机制可能为IGF-1激活PI3K/Akt信号转导通路，通过调节神经细胞的凋亡和自噬，从而改善VaD小鼠的认知功能。第三部分：血管性痴呆小鼠海马组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表达水平变化及左旋丁苯酞的影响目的：观察血管性痴呆小鼠海马组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表达水平的变化及l-NBP的干预作用。方法：造模4周后采用Western-Blot方法测定各组小鼠海马组织中Akt、p-Akt Ser473、mTOR和p-mTOR Ser2448蛋白的变化；采用免疫组化方法测定各组小鼠海马组织中p-Akt Ser473蛋白的变化。结果：1左旋丁苯酞对Akt、p-Akt Ser473蛋白表达的影响脑反复缺血再灌注术后4周各组之间Akt总蛋白表达无明显差异(P>0.05)；与sham组相比，IR组、Pre-l-NBP组、Low-l-NBP组和High-l-NBP组p-Akt Ser473蛋白表达明显增强（P<0.01）；与IR组相比，Pre-l-NBP组、Low-l-NBP组和High-l-NBP组三组p-Akt Ser473的表达明显增强（P<0.01）。2左旋丁苯酞对mTOR、p-mTOR Ser2448蛋白的表达的影响：脑反复缺血再灌注术后4周各组之间mTOR总蛋白表达无明显差异(P>0.05)；IR组海马组织p-mTOR Ser2448的蛋白明显高于sham组（P<0.01）。Pre-l-NBP组、Low-l-NBP组和High-l-NBP组三组海马组织p-mTOR Ser2448的蛋白表达明显高于IR组（P<0.01, P<0.05）。结论：1脑反复缺血再灌注4周后，VaD小鼠海马组织中p-Akt Ser473、p-mTOR Ser2448的表达明显增多。提示脑反复缺血再灌注使PI3K/Akt通路活化，Akt和mTOR活化可抵抗缺血引起的损伤，在神经元的存活中发挥着重要的作用。2左旋丁苯酞可促进VaD小鼠海马组织中p-Akt Ser473和p-mTORSer2448的表达。提示该药可能通过激活PI3K/Akt通路，促进p-Akt Ser473和p-mTOR Ser2448的表达，从而发挥神经保护作用，改善小鼠认知功能障碍和神经损害。第四部分：血管性痴呆小鼠海马组织中自噬因子LC3B和Beclin1表达水平变化及左旋丁苯酞的影响目的：观察血管性痴呆小鼠海马组织中LC3B和Beclin1蛋白及mRNA表达的变化及l-NBP的干预作用。方法：造模4周后应用Western Blot方法测定各组小鼠海马组织中LC3B蛋白表达的变化，应用FQ RT-PCR方法测定各组小鼠海马LC3B和Beclin1mRNA表达的变化结果：1LC3B蛋白的表达情况：术后4周IR组海马组织LC3B蛋白表达明显高于sham组、Pre-l-NBP组和High-l-NBP组（P<0.01）。2LC3B、Beclin1的mRNA表达水平IR组小鼠海马LC3B mRNA和Beclin1mRNA的表达比Sham组明显增加（P<0.05）；Pre-l-NBP组、Low-l-NBP组和High-l-NBP组三组海马组织中LC3B mRNA和Beclin1mRNA的表达无组间差异（P>0.05），与Sham组相比无统计学差异（P>0.05），但较IR组明显下降（P<0.01,P<0.05）。结论：1脑反复缺血再灌注4周后，小鼠海马组织LC3B蛋白、LC3B mRNA和Beclin1mRNA表达均显著升高，与小鼠行为学改变和神经元损伤基本一致。2左旋丁苯酞降低小鼠海马组织LC3B蛋白、LC3B mRNA和Beclin1mRNA表达（与其上游抑制物p-mTOR的表达相反）。提示l-NBP可能通过激活PI3K/Akt通路抑制自噬，从而减少VaD小鼠海马神经元损伤，减轻认知功能障碍。第五部分：血管性痴呆小鼠侧脑室室管膜扫描电镜的变化特征及左旋丁苯酞的影响目的：观察VaD小鼠侧脑室脉络丛上皮细胞和室管膜细胞的超微结构变化，以及l-NBP的影响。方法：通过扫描电镜观察造模4周后sham组、IR组和High-l-NBP组小鼠侧脑室脉络丛上皮细胞和室管膜细胞超微结构的变化。结果：1小鼠侧脑室脉络丛上皮细胞超微结构特点Sham组侧脑室脉络丛上皮细胞细胞胞体形状规则，细胞之间界限清晰，微绒毛密布上皮细胞游离面，较粗短，细胞表面可见大小不一的分泌泡。IR组小鼠侧脑室脉络丛上皮细胞形状变得极不规则，有的细胞有突起，有的呈沟回样皱缩，有的细胞表面光滑，并可见大量的分泌泡，分泌物增多，细胞间界限不清，细胞表面呈泥沙样堆积，脉络丛上皮细胞上微绒毛明显减少甚至消失。High-l-NBP组小鼠侧脑室脉络丛上皮细胞排列尚规律，细胞间界限较清晰。2小鼠侧脑室室管膜表面超微结构特点sham组小鼠可见室管膜上皮细胞表面带有大量的纤毛和微绒毛，纤毛，粗细较为均匀，在纤毛的空隙处，分布着众多的微绒毛。IR组小鼠室管膜上皮细胞表面可见纤毛稀疏、倒伏，部分粘附呈缕。部分纤毛表面粘附絮状物，可见纤毛和微绒毛被“淤泥状”分泌物呈片状覆盖。High-l-NBP组小鼠室管膜上皮细胞表面的纤毛和微绒毛较IR组明显增多。结论：1VaD小鼠侧脑室脉络丛上皮细胞及室管膜细胞出现超微结构异常，提示脉络丛上皮细胞和室管膜的异常可能参与了VaD的发病机制。2左旋丁苯酞可以减轻VaD小鼠侧脑室脉络丛上皮细胞室管膜的超微结构异常，从而改善认知功能障碍。