目的：近年来,西罗莫司作为新型免疫抑制剂在抑制角膜新生血管的效用得到广泛关注,有实验证实西罗莫司对角膜碱伤后的病理状态下的角膜新生血管有良好的抑制作用。但是由于眼球自身血一眼屏障和角膜屏障等解剖特点,全身用药达到有效血药浓度时,眼内药物浓度几近微量,无法达到有效的药物浓度和持续时间。目前,西罗莫司仅为口服制剂,口服全身给药后不良反应严重,而其眼用剂型的研究却相对滞后。西罗莫司分子量较大,水溶性差,受到p-gp系统的外排作用,使其在眼表局部应用时的眼内吸收差。本实验拟采用具有增溶、缓释和抑制p-gp系统外排作用的材料制备新型眼用递药系统：壳聚糖包覆脂质体-原位凝胶,并对其理化性质、体外释放、药代动力学等进行研究评价,以期为临床提供新型高效、安全的西罗莫司滴眼液。脂质体(liposome)具有磷脂双分子膜结构,具有亲水性与疏水性,易与生物膜融合,具有增加角膜通透性,缓释、降低毒性、减小药物浓度波动的优点。有报道带有正电荷的脂质体易与带负电荷的角膜产生吸附作用,具有更强的亲和力,利于药物在角膜前的铺展从而促进药物的眼部吸收。壳聚糖(Chitosan, CS)是自然界唯一的碱性多糖,其衍生物为可生物降解的天然聚合物,无毒,具有良好的生物相容性、高电荷密度和黏膜黏附性。近来研究表明,CS及其衍生物可以提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物稳定性,同时,还具有一定的抑制P-gp的外排作用。因此,采用壳聚糖或其衍生物包覆脂质体,将使脂质体的穿透性、粘附性、抗P-gp外排作用增强。此外,目前柔性脂质体和微乳的研究也日趋成熟。柔性脂质体是在普通脂质体磷脂双分子层中加入表面活性剂如胆酸钠等,除具有普通脂质体作为角膜给药系统的优点外,还具有高度柔韧性及高效渗透的性质。微乳(Microemulsion)是由水相、油相、表面活性剂构成的透明或者半透明的、低黏度的混合体系。微乳滴具有巨大的比表面积,能促进药物角膜吸收,提高眼部药物的生物利用度。为了最终筛选出一种安全、组织相容性好、眼部生物利用度高的西罗莫司新型眼用递药系统,本文以柔性脂质体和微乳为眼用参比制剂进行对比研究。最后,结合原位凝胶(in situ gel)的相变特点,它可进一步延长药物在角膜的滞留时间,达到缓释作用。因此,本实验所研究的新型眼用递药系统,即眼用壳聚糖包覆西罗莫司脂质体-原位凝胶、眼用壳聚糖包覆西罗莫司柔性脂质体-原位凝胶、眼用壳聚糖包覆西罗莫司微乳-原位凝胶。并对三种新型原位凝胶的处方工艺、质量、眼部刺激性和药代动力学等进行研究评价。方法：利用薄膜分散法结合探头超声粉碎法来制备脂质体、柔性脂质体,结合包封率大小和水化难易程度作为指标,来确定最优处方工艺。与此同时制备西罗莫司微乳,并对原位凝胶处方工艺进行优化,进而配制出三种新型眼用原位凝胶剂。分别对脂质体、柔性脂质体和微乳进行粒径、电位等理化性质的考察,对凝胶制剂进行胶凝温度、pH值和黏度等理化性质的考察。同时建立高效液相色谱方法学对这三种新型原位凝胶制剂的进行含量测定,并采用无膜溶出模型对其释放机制进行研究。随后,利用裂隙灯显微镜结合组织学检查、评价这三种凝胶对大鼠角膜的眼部刺激性。最后,对三种凝胶制剂进行兔眼药代动力学的研究(n=4),实验A组给予壳聚糖包覆西罗莫司脂质体-原位凝胶,实验B组壳聚糖包覆西罗莫司柔性脂质体-原位凝胶,实验C组给予壳聚糖包覆西罗莫司微乳-原位凝胶,对照组给予西罗莫司-蓖麻油滴眼液(浓度0.2%)。分别于样品滴眼后0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、12h、24h,采集房水和角膜样品以测定其中的西罗莫司含量,并对结果采用DAS2.1软件进行药代学拟合分析。结果：配制的三种原位胶凝符合眼用制剂的要求。建立高效液相色谱分析法来进行含量测定和体外释放研究,经回归分析得到三种原位凝胶的累积溶蚀-释放方程,其斜率都接近于1,说明影响三者药物释放的主要因素就是凝胶的溶蚀。刺激性试验期间大鼠眼角膜均无混浊,虹膜和结膜未见红肿、充血、肿胀等异常现象；滴入2%荧光素钠用裂隙灯显微镜检查后,大鼠眼角膜也未见染色反应；且试验组各只动物给药及观察期间均未见烦躁、嗜睡等异常行为。依据评分标准,给药期间各时间点眼刺激性评分数值均为0；组织学检查显示：阳性碱伤组大鼠眼角膜松散,表面鳞状上皮结缔组织结构损坏致脱落,有炎症细胞浸润；而试验组大鼠左右眼角膜均完好,表面鳞状上皮结缔组织结构清晰可见,无坏死脱落,无溃疡形成,也未见炎症细胞浸润。结果表明眼用西罗莫司壳聚糖包覆脂质体原位凝胶无刺激性,可用于眼部给药。采用DAS2.1.1软件对四种制剂药代动力学各数据进行隔室模型拟合,结果为均符合二室模型(权重系数1/cc)。实验B组西罗莫司房水AUC(0-t)是对照组的12.47倍,是实验A组的2.64倍,是实验C组的3.43倍；实验B组西罗莫司在眼角膜中AUC(0-t)是对照组的8.93倍,是实验C组的1.44倍。且实验组在房水中作用时间比对照组显著延长,明显发挥缓控释制剂的作用。实验组的房水和角膜中平均药物浓度均比对照组的高。结论：通过含量测定和体外释放等质量研究,初步证实其充分结合了脂质体、柔性脂质体、微乳以及原位凝胶等剂型的特点,成为协同的复合剂型。在体外释放过程中,三种新型原位凝胶制剂凝胶的溶蚀是控制药物释放的主要因素。通过对体外释放数据进行分析得出,眼用壳聚糖包覆西罗莫司脂质体-原位凝胶和壳聚糖包覆西罗莫司柔性脂质体-原位凝胶具有更好的缓释效果,可进一步延长药物眼部滞留时间。在刺激性实验中,通过裂隙灯显微镜和组织学检查后,证实三种凝胶制剂对角膜均无损伤,初步说明三种眼用新制剂均无刺激性,在眼部是安全的,组织学研究也显示其具有良好的生物生物相容性。药代动力学研究结果显示,相比于实验A组壳聚糖包覆西罗莫司脂质体-原位凝胶、实验C组壳聚糖包覆西罗莫司微乳-原位凝胶和对照组西罗莫司-蓖麻油滴眼液来讲,实验B组壳聚糖包覆西罗莫司柔性脂质体-原位凝胶,显著提高西罗莫司的眼生物利用度(P<0.05),是四种剂型之中最有效、可靠、安全的眼用新剂型,具有良好的临床应用前景。