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该课题应用截短的甲胎蛋白(AFP)基因顺式作用元件和超抗原~金黄色葡萄球菌肠毒素-A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)以及CD80分子跨膜序列基因(CD80TM)重组,设计并构建能将免疫活化剂SEA表达于细胞膜的肝癌特异性免疫基因治疗载体pLXSN-EPSC,并检测细胞膜表达的SEA在体外强化肝癌特异性免疫反应的能力.1.该课题设计的AFP顺式作用元件截去了沉寂子和大部分非反式作用元件结合位点,使SEA-Linker-CD80TM的转录处于AFP顺式作用元件的调控之下,读框分析证实与设计一致.2.从HepG2细胞的基因组DNA中克隆了最小的AFP启动子(0.3kb)和增强子(-4.0~-3.3kb)序列,再将缩短的增强子、启动子连接,作为肝癌特异性顺式调控元件.3.接下来分别克隆了超抗原SEA和linker-CD80TM基因,构建了肝癌特异性的超抗原基因治疗载体pLXSN-EPSC.将pLXSN-EPSC分别转染AFP阳性(AFP<+>)、AFP阴性(AFP<->)肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721,以及宫颈癌细胞系Hela.4.体外免疫学实验表明HepG2-SEA在有明显的促PBMC增殖作用.用表达SEA的HepG2反复刺激PBMC,获得了富含CD8<+>T细胞的淋巴细胞系.用ELISPOT技术检测发现该T淋巴细胞系中有大量的肝癌反应性CTL,与对照组相比较有显著性差异,总之,该课题构建的以超抗原为基础的肝癌特异性基因治疗载体,显示了AFP基因调控和超抗原抗肿瘤的明显效果,在基因转录水平定量、定向、特异性的调控细胞和体液免疫活化剂(SEA),具有肿瘤基因治疗和免疫治疗的双重特点,为肝癌的基因免疫治疗开辟新的途径.