近年来,消化道肿瘤的发病率、确诊率和死亡率逐年升高,其中又以胃癌、肝癌、结肠癌和胰腺癌为主。在中国,胃癌、结肠癌、肝癌在所有癌症中的发病率位列第2-4名,而胰腺癌又因其早期诊断难、治疗效果差和生存时间短,同样引起了人们广泛的关注。这些消化道肿瘤会引起患者营养不良、电解质失衡、血糖控制差、频繁入院进行治疗等,严重影响患者的生活质量,甚至造成死亡,增加了整个社会及患者的精神负担和经济负担。虽然针对癌症的预防、诊断和治疗技术不断发展,并在一定程度上抑制了这4种消化道肿瘤的发生和发展,但其预后依然不尽如人意。所以,探究并掌握这些消化道肿瘤增殖、侵袭和转移的相关机制,对于提高肿瘤治疗效果和预后意义重大。二甲双胍是人们所熟知的针对2型糖尿病的临床一线用药,由山羊豆提取而来,其降糖机制大致分为抑制肝脏葡萄糖输出,促进骨骼肌摄取葡萄糖和抑制肠道葡萄糖吸收三类。二甲双胍价格低廉,目前全世界大约有1.2亿糖尿病患者服用二甲双胍控制血糖。除了治疗2型糖尿病,二甲双胍还被用于治疗多囊卵巢综合症、代谢综合征和糖尿病预防。近年来,各种临床证据表明,患有乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和头颈部癌的2型糖尿病患者,在服用二甲双胍后其总体生存率得到大幅提升。大量体外实验也证实,二甲双胍能够抑制多种人体恶性肿瘤细胞的增殖,包括胃癌、胰腺癌、甲状腺髓样癌和子宫内膜癌。尽管二甲双胍的抗癌作用逐渐被人们发现,但是其对抗癌症的机制却一直没有被完全阐明。腺苷酸活化蛋白激酶是一种异源三聚体形的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物,由一个α-催化亚基、一个β-调节亚基和一个γ-调节亚基组成。AMPK的主要作用是应答细胞外界的各种刺激并维持细胞内能量的供求平衡,在细胞代谢中起到重要作用。二甲双胍通过激活LKB1-AMPK-ACC信号通路,抑制肝脏糖异生,促进脂肪酸氧化,从而降低血糖水平并提高胰岛素敏感性。已有研究表明,二甲双胍发挥抗癌作用的机制之一,便是诱导AMPK磷酸化使其活化,致下游多个信号通路激活,抑制或促进相关促癌或抑癌蛋白的表达,达到阻断癌细胞生长的效果。然而,二甲双胍更多潜在的抑癌机制尚待发掘。为了进一步研究二甲双胍抑制肿瘤发生发展的分子机制,本课题利用细胞生物学、分子生物学及动物实验研究二甲双胍诱导AMPK磷酸化后抑制消化道肿瘤增殖、侵袭和转移的分子机制。在本课题中,我们将进行：1、二甲双胍诱导AMPK磷酸化的作用研究。2、二甲双胍抑制胃癌和胰腺癌增殖和侵袭的作用研究。3、二甲双胍激活AMPK/mTOR信号通路抑制胃癌细胞增殖能力的机制研究。4、二甲双胍激活AMPK/Akt/FoxMl信号通路抑制胰腺癌细胞、肝癌细胞及结肠癌细胞增殖、侵袭和转移能力的机制研究。1.二甲双胍诱导AMPK磷酸化的作用研究目的：探究AMPK在肿瘤组织中的活性表达并验证二甲双胍对于AMPK活性的调节作用方法：收集人体胃癌及癌旁组织病理切片,对其进行p-AMPK免疫组织化学染色,比较p-AMPK在胃癌和癌旁组织中的表达水平。利用裸鼠种植瘤实验构建胃癌细胞皮下瘤动物模型,进行二甲双胍干预治疗,随后取皮下瘤组织进行p-AMPK免疫组织化学染色,比较二甲双胍干预前后p-AMPK表达水平的变化,验证二甲双胍对于AMPK活性的调节作用。结果：在人体胃癌组织中,p-AMPK的表达水平与癌旁正常组织相比较表达降低。经过二甲双胍干预治疗后的裸鼠,其皮下瘤组织中p-AMPK的表达水平明显高于未经二甲双胍干预的空白对照组。结论：AMPK在胃癌组织中活性下降,提示其可能发挥抑癌作用。二甲双胍能够诱导AMPK磷酸化,提高AMPK在肿瘤组织中的活性。2.二甲双胍抑制胃癌和胰腺癌增殖和侵袭能力的作用研究目的：探究二甲双胍对于胃癌及胰腺癌增殖和侵袭的干预作用方法：配置不同二甲双胍浓度的培养液分别对胃癌及胰腺癌细胞进行体外培养,在一定时间后观察癌细胞的增殖和细胞集落形成情况,并与空白对照组进行比较。对二甲双胍处理组和非处理组的胰腺癌细胞进行划痕实验,24h后观察划痕宽度变化。利用流式细胞分析技术检测经不同浓度二甲双胍处理48h后的胃癌细胞的周期变化。利用裸鼠种植瘤实验构建胃癌细胞及胰腺癌细胞皮下瘤动物模型,分别进行二甲双胍干预治疗,观察皮下瘤生长情况并与空白对照组进行比较。收集因患有2型糖尿病而服用二甲双胍控制血糖的胃癌患者的病历资料,统计其中位生存时间,与未使用二甲双胍组进行比较。结果：胃癌及胰腺癌细胞在经过二甲双胍干预处理后,癌细胞的增殖和集落形成能力下降,下降程度与二甲双胍浓度呈正相关。对二甲双胍处理组和非处理组的胰腺癌细胞进行划痕实验,24h后可见非处理组划痕宽度明显小于二甲双胍处理组。二甲双胍处理组胃癌细胞的S周期含量显著降低。使用二甲双胍喂养的皮下瘤裸鼠,其肿瘤的生长速度显著降低。服用二甲双胍控制血糖的2型糖尿病胃癌患者的中位生存时间高于未服用患者。结论：二甲双胍能够抑制胃癌细胞和胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力,降低癌细胞成瘤能力,影响胃癌细胞的细胞周期,提高胃癌患者生存时间。3.二甲双胍激活AMPK/mTOR信号通路抑制胃癌细胞增殖能力的机制研究目的：研究二甲双胍抑制胃癌细胞增殖能力的内在机制方法：使用不同浓度的二甲双胍对胃癌细胞进行体外干预处理,收取并裂解细胞获取细胞内蛋白,通过Western blot技术检测各组细胞内AMPK和mTOR及下游蛋白的活性和表达情况。利用裸鼠种植瘤实验构建胃癌细胞皮下瘤动物模型,进行二甲双胍干预治疗,通过免疫组织化学染色检测皮下瘤组织内AMPK和mTOR及下游蛋白的活性和表达情况。结果：p-AMPK的表达随二甲双胍浓度的升高而升高,p-mTOR的表达随二甲双胍浓度的升高而降低,其下游p-70S6、pS6和p4E-BP1的表达亦降低。结论：二甲双胍可以通过激活AMPK/mTOR信号通路,使下游一些促进细胞增殖的靶蛋白表达降低,从而抑制胃癌细胞的增殖能力。4.二甲双胍激活AMPK/Akt/FoxMl信号通路抑制胰腺癌细胞、肝癌细胞及结肠癌细胞增殖、侵袭和转移能力的机制研究目的：研究二甲双胍抑制胰腺癌细胞、肝癌细胞及结肠癌细胞增殖、侵袭和转移能力的内在机制。方法：使用不同浓度的二甲双胍对胰腺癌、肝癌及结肠癌细胞进行不同时长的体外干预处理,收取并裂解细胞获取细胞内蛋白,通过Western blot技术检测各组细胞内AMPK、Akt及FoxMl等蛋白的活性和表达情况。结果：p-AMPK和E-cadherin的表达随二甲双胍的浓度及处理时间的升高而升高,p-Akt、FoxM1、β-catenin、cyclinB1、cyclinD1、vimentin和N-cadherin的表达随二甲双胍的浓度及处理时间的升高而降低。结论：二甲双胍可以通过激活AMPK/Akt/FoxMl信号通路,使下游某些与肿瘤细胞增殖、侵袭和转移相关的靶蛋白表达升高或降低,从而抑制胰腺癌细胞、肝癌细胞及结肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。经过上述研究,本课题得到如下结论：(1) AMPK在胃癌组织中活性下降,提示其可能发挥抑癌作用。二甲双胍能够诱导AMPK磷酸化,激发AMPK活性,提高AMPK在肿瘤组织中的表达。(2) 二甲双胍能够抑制胃癌细胞和胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力,降低癌细胞成瘤能力,影响胃癌细胞的细胞周期,提高胃癌患者生存时间。(3) 二甲双胍可以通过激活AMPK/mTOR信号通路,使下游的70S6K、S6和4E-BP1蛋白的活性降低,从而抑制胃癌细胞的增殖能力。(4) 二甲双胍可以通过激活AMPK/Akt/FoxM1信号通路,使下游某些与肿瘤细胞增殖、侵袭和转移相关的靶蛋白表达升高或降低,从而抑制胰腺癌细胞、肝癌细胞及结肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。