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本论文主要针对慢生根瘤菌普遍存在耐盐性差的特点,以及这些资源难以在我国大面积应用的现状,选择与两种主要豆科植物—花生和大豆共生结瘤良好的花生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.(Arachis)2764)和大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA110)为材料,运用基因工程的手段,将与生物耐盐相关的两个基因—betH(初步确定编码甘氨酸甜菜碱转运蛋白)及betAB(编码甘氨酸甜菜碱合成蛋白)分别导入根瘤菌,构建耐盐的根瘤菌工程菌株,并进行耐盐基因表达及生理特性的相关测定分析。论文的主要结果摘要如下: 1、将编码甘氨酸甜菜碱转运蛋白的基因betH导入根瘤菌,获得工程菌354株,其中以质粒形式存在的工程菌4株,基因插入到基因组上的工程菌350株。经耐盐性筛选,有2株工程菌(2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5)的耐盐性由80mM提高到120mM,较出发菌株提高50%。 2、将编码甘氨酸甜菜碱合成蛋白的基因betAB导入根瘤菌,构建以质粒形式存在的工程菌2株,经耐盐性筛选,有1株工程菌(2764/betAB)的耐盐性由80mM提高到120mM,较出发菌株提高50%。 3、对转入上述2个与耐盐相关基因表达的研究结果表明,工程菌2764/betAB耐盐性的提高与甜菜碱的含量正相关,其甜菜碱含量是出发菌株的3.2倍;而工程菌2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5的甜菜碱含量较出发菌株却未见明显变化。进一步测定工程菌2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5细胞内游离氨基酸含量,发现其中5种氨基酸含量有明显变化,推测它们与根瘤菌的耐盐性相关。 4、对耐盐工程菌进行了生长速度(代时)、耐旱性、稳定性和结瘤能力等生理特性方面的测定,结果表明:(1)工程菌与出发菌株的代时相差1-2小时,导入betH和betAB基因可延缓菌的生长繁殖速度,但变化不明显;(2)工程菌的耐旱性都略低于或与出发菌株的耐旱性相当,暗示导入基因与耐旱性不直接相关;(3)整合到基因组上的外源基因可稳定存在,2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5因基因插入到基因组上,在无选择压力下,连续转接5次后基因仍稳定存在,而2764/betAB的稳定性较差,在无选择压力下,重组质粒很容易丢失。(4)蛭石结瘤实验表明,3株耐盐的根瘤菌工程菌株中2764/pSZ1.5、2764/betAB能够正常结瘤,且对植株的生长有明显促进作用,尤其是工程菌2764/pSZ1.5。工程菌2764/pSZ1.5、2764/betAB在加入100mM NaCl的情况下仍能够结瘤,虽然结瘤量明显减少,但出发菌株在此情况下完全不结瘤。工程菌110/pSZ1.5在正常盐浓度及加盐的情况下,三次重复都没有结瘤,且对植株生长产生抑制作用。 综合以上实验结果,3株耐盐的根瘤菌工程菌株应用前景是,110/pSZ1.5对植株的结瘤固氮性能及生长状况产生抑制作用,不可以应用;2764/betAB对植株的结瘤固氮性能及生长状况没有影响,但稳定性差,也达不到应用的要求;只有2764/pSZ1.5不仅对植株的结瘤固氮性能没有影响,且对植株的生长有明显促进作用,尤其在高渗环境中能够结瘤,并提高植株的生物量,可以进行工程菌的小面积示范,并进一步开展其耐盐机理研究,本研究为提高固氮性能优良的根瘤菌的耐盐特性提供了一条可行的途径。