血小板常规储存于22℃震荡条件下,鉴于储存损伤和细菌污染的风险,其有效期被严格限定于5天以内。苛刻的储存条件和较短的储存期限共同导致血小板的长期供应不足,同时也不利于血小板制品向偏远地区、灾害现场、军事冲突区域的及时供应。冰冻储存血小板(Cryopreserved platelets,CPPs)细菌污染风险小,有效期长达2年,可在很大程度上缓解血小板供应不足、运输不便的问题。虽然CPPs输注后体内复苏率仅约为新鲜血小板的50%,在提高血小板计数方面作用有限,但大量的基础和临床研究表明,CPPs具有显著的即刻止血功能,特别适合于战、创伤失血与术中出血的止血治疗。CPPs因其突出的储运优势和止血功能在战伤失血性休克(Hemorrhagic shock,HS)的救治中拥有广阔的应用前景。目前,美国、荷兰军方及德国的保罗埃尔利希研究所已将CPPs列入战时血液储备计划,然而除了法国政府批准于民用外,尚未有其它国家或地区主管部门批准其作为正式的血液制品应用于临床。在我国,CPPs也未被列入标准血液产品目录,仅用于自体血小板输注治疗和少数基层医院的血液保障。CPPs没有获得国家批准的主要原因在于对CPPs输入后的不良反应监测不全,临床应用风险评估不足。众所周知,血小板除了发挥止血功能外,还介导炎症反应和免疫调节。临床研究表明,输注常规储存血小板比输注其他血液成分(如红细胞、血浆)更易引起输血相关急性肺损伤(Transfusion related acute lung injury,TRAIL)的发生。同时,血小板在多种组织的缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)中发挥重要作用。在肝脏缺血早期,血小板与枯否细胞(Kuffer cell,KC)发生粘附,迅速在肝内聚集,并通过活化KC促使其释放溶酶体酶、诱导肝血窦内皮细胞凋亡、介导中性粒细胞粘附聚集等方式加重肝损伤。因此,CPPs输入后也可能引起组织的炎性损伤,特别是大量失血后输注,会加重对机体的二次打击损伤。CPPs输注后对机体炎性损伤的影响未见报道,安全性数据的缺失严重制约了CPPs的推广和应用。本研究选用繁殖能力强、对外来刺激敏感、适合免疫学与分子机制研究的BALB/C小鼠建立失血性休克模型,模拟临床条件进行CPPs输注实验,通过血清肝肾功能生化指标、组织炎性因子检测,免疫组化与病理分析等方法对CPPs输注后组织炎性损伤情况进行全面的评价,从而为CPPs临床应用的安全性考察及其不良反应防治奠定实验基础。第一章:小鼠血小板提取与储存方法的建立建立稳定的小鼠血小板提取与储存方法是进行CPPs体内输注实验,全面考察其对失血性休克组织炎性损伤影响的前提。根据文献调研结果,我们采用BALB/C小鼠呼吸机给氧条件下心脏穿刺取血,14%的枸橼酸磷酸葡萄糖腺嘌呤-1(Citrate phosphate dextrose adenine-1,CPDA-1)抗凝,X30型滤器过滤去除全血中的白细胞,300g离心8min的方法获取上层富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)。按照常规方法和荷兰军方的方法进行小鼠血小板的22℃震荡储存和-80℃冰冻储存。根据小鼠血小板在体内外的生存特点,定义22℃震荡储存1h以内的血小板为新鲜血小板(Fresh platelets,FPs),22℃震荡储存16h的血小板为液态储存血小板(Liquid-preserved platelets,LPPs),-80℃冰冻储存48h的血小板为冰冻血小板(Cryopreserved platelets,CPPs)。通过血细胞计数、血气分析和血栓弹力图(Thrombelastograph,TEG)检测评价提取与储存过程血小板的质量变化。结果表明:小鼠呼吸机给氧条件下心脏穿刺取血成功率达93.6%,平均每只小鼠取血1ml。14%CPDA-1抗凝效果良好,未见凝血现象发生。小鼠抗凝全血过滤后白细胞(White blood cell,WBC)滤除率可达(85.15±6.06)%,且对红细胞(Red blood cell,RBC)、血小板(Platelet,PLT)计数结果无影响。离心后WBC、RBC总体残余率分别为(5.14±2.78)%、(0.15±0.05)%,PLT提取率为(79.42±14.92)%,计数值为(479.75±61.22)×109/L,可满足储存、输注实验要求。与新鲜血小板相比,小鼠PRP经22℃震荡储存16h后WBC、RBC、PLT、血小板平均体积(Mean platelet volume,MPV)均无显著差异,未出现细胞聚集或破裂现象;TEG检测中R、MA、Angle无明显差异,凝血状态正常;血气分析中酸碱度(p H)、碱剩余(BE)、碳酸氢根浓度(c HCO3-)降低,血乳酸浓度(c Lac)升高,符合血小板储存过程中能量消耗、乳酸堆积、p H下降的变化趋势,能够代表22℃震荡储存血小板的代谢特点。经-80℃冰冻储存48小时后PLT无显著差异,WBC、RBC、MPV显著升高,可能与复溶血浆中混有少量WBC、RBC细胞及DMSO对血小板的胞内扩容作用有关;p H、BE、c HCO3-无显著变化,与血小板代谢活动在低温环境受到抑制有关;TEG检测中R、MA、Angle均明显降低,提示促凝活性升高,血凝块强度减弱。小结:建立了稳定的小鼠血小板提取与储存方法,22℃震荡储存16h和-80℃冰冻储存48h的血小板在血细胞计数、血气分析、凝血功能变化等方面能够代表两种方式储存血小板的特点,满足下一步输注实验要求。第二章:冰冻血小板输注对失血性休克小鼠组织炎性损伤影响的研究小鼠30%失血性休克模型血流动力学变化过程接近临床,适于失血性休克后代谢情况、病理生理、存活情况及治疗策略的研究。我们通过股动脉插管技术建立BALA/C小鼠30%失血性休克模型。实验分为三组:Fresh组、Old组和Frozen组,稳定1h后分别输注等失血量的FPs、LPPs和CPPs,通过检测输注前和输注6h后血清肝肾生化指标及输注6h后肝、肺、肾病理改变,考察三种血小板输注对失血性休克小鼠组织炎性损伤的影响。结果表明:失血性休克小鼠输注血小板前,三组丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(Creatinine,CREA)含量没有显著差异。输注血小板6小时后,三组ALT、AST含量均明显升高,BUN、CREA含量均明显降低;Frozen组ALT、AST含量显著高于Old组。三组间BUN、CREA含量没有显著差异。肝组织病理分析显示,Fresh组以窦隙中少量散在炎症细胞浸润为主;Old组以窦隙中散在炎症细胞浸润,局部肝组织窦隙扩张,孤立性炎症病灶出现为主;Frozen组以窦隙中散在炎症细胞浸润,局部肝组织窦隙扩张,孤立性炎症病灶或肝细胞点状坏死灶出现,坏死肝细胞为炎症细胞代替为主。三组肝组织病理学评分差异显著,Frozen组肝组织损伤最重。肺组织病理分析显示,Fresh组以肺组织结构清晰,未见异常为主;Old组以肺组织间质散在炎症细胞浸润,局部肺泡间隔轻度增厚为主;Frozen组以肺组织间质散在炎症细胞浸润,局部肺泡间隔增厚,肺泡腔轻度缩小,中性粒细胞增多为主。三组肺组织病理学评分差异显著,Frozen组肺组织损伤最重。肾组织病理分析显示,Fresh组以肾组织结构清晰,未见异常为主;Old、Frozen组以局部肾组织间质散在炎症细胞浸润,主要是淋巴细胞和单核细胞为主。三组肾组织病理学评分无显著差异。小结:相对于FPs和LPPs,CPPs能够加重肝、肺组织的炎性损伤;三种血小板致肾脏损伤作用均不明显;提示不同组织对血小板炎性损伤的敏感性不同。第三章:冰冻血小板输注加重失血性休克小鼠肝损伤的机制探讨通过测定肝脏组织匀浆炎性因子和趋化因子(肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-a,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、巨噬细胞趋化因子-2(Macrophage inflammatory protein 2,MIP-2))表达、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)含量,及肝组织石蜡切片巨噬细胞特异性抗体F4/80免疫组织化学染色的结果,探讨CPPs加重肝组织炎性损伤可能的作用机制。结果表明:Frozen组F4/80阳性细胞数量显著多于Fresh组和Old组,Old组F4/80阳性细胞数量也多于Fresh组;Frozen组TNF-α、IL-1β、IL-6、MIP-2含量均高于Fresh组,Frozen组TNF-α含量显著高于Old组,Old组IL-6含量显著高于Fresh组。说明相对于Fresh组,Frozen组和Old组KC数量更多、活化程度更高,以Frozen组最为明显。KC的聚集活化与肝脏的病理损伤程度一致。Frozen组MPO含量显著高于Fresh组和Old组,Fresh组与Old组之间MPO含量无显著差异,说明相对于Fresh、Old两组,Frozen组中性粒细胞在肝脏粘附聚集增多。小结:相对于FPs和LPPs,CPPs促进了肝脏中KC的聚集活化和中性粒细胞的粘附聚集;CPPs加重失血性休克小鼠肝损伤的机制可能与KC和中性粒细胞的聚集活化有关。第四章:冰冻血小板输注加重失血性休克小鼠肺损伤的机制探讨通过测定肝脏组织匀浆炎性因子和趋化因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、MIP-2)表达、MPO含量,及肺组织石蜡切片巨噬细胞特异性抗体F4/80和中性粒细胞特异性抗体Ly-6G免疫组织化学染色的结果,探讨CPPs加重肺组织炎性损伤可能的作用机制。结果表明:Frozen组Ly-6G阳性细胞数量显著多于Fresh组和Old组,Old组Ly-6G阳性细胞数量也多于Fresh组;Frozen组MPO含量显著高于Fresh组和Old组,Fresh组与Old组之间无差异。说明相对于Fresh组,Frozen组和Old组中性粒细胞数量更多,活化情况更高,以Frozen组最为明显。中性粒细胞的聚集活化与肺的病理损伤程度一致。Frozen组与Old组之间F4/80阳性细胞数量无显著差异,均多于Fresh组;Frozen组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明显低于其它两组,Old组IL-1β含量高于Fresh组。说明对于Fresh组,Frozen组和Old组巨噬细胞数量增多,但Frozen组巨噬细胞活性可能较低。小结:相对于FPs和LPPs,CPPs促进了肺部中性粒细胞的浸润,中性粒细胞浸润情况与肺部病理损伤程度一致,提示CPPs致肺损伤可能与中性粒细胞浸润有关。相对于FPs,LPPs和CPPs促进了巨噬细胞在肺部的聚集。综上所述,本研究建立了小鼠血小板制备和储存的技术平台,并在此基础上探讨了不同血小板制品(新鲜血小板、22℃震荡储存血小板和-80℃冰冻储存血小板)输入失血性休克小鼠体内对小鼠组织炎性损伤的影响,结果表明:(1)与新鲜和22℃震荡储存血小板相比,-80℃冰冻储存血小板输注后,不加重肾组织损伤,但明显加重肝、肺组织炎性损伤,提示不同组织对血小板所致炎性损伤的敏感性不同。(2)-80℃冰冻储存血小板致肝、肺组织炎性损伤的作用机制可能存在差异。已知中性粒细胞和巨噬细胞是引起组织炎性损伤的重要因素。本研究发现-80℃冰冻储存血小板输入后,介导中性粒细胞在肺内聚集可能是引起肺损伤的关键因素,而介导巨噬细胞在肝脏聚集在肝损伤中发挥重要作用。提示可以针对-80℃冰冻储存血小板致肝、肺组织炎性损伤不同的作用机制,研究相应的防治措施。