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恶性肿瘤是人类尚未攻克的医学难题,绝大多数癌症给人类带来巨大的生命威胁。目前对恶性实体肿瘤的治疗仍以手术切除和放化疗为主,在清除癌细胞的同时给机体带来伤害甚至是致命的打击。基因治疗研究逐渐成为热点。研究肿瘤发生发展的分子机制可以为开发新的治疗手段提供理论依据和实验基础。microRNA,一个不足30个核苷酸的微小分子以其复杂的信号网络和对细胞的多方面生物学行为影响成为医学科学研究领域的另一热点。它和肿瘤疾病之间的密切联系已经为人们所熟知,而其中具体的分子机制研究却并不透彻。肿瘤细胞自身所特有的物质能量代谢特征,其中隐藏的分子机制可以作为治疗肿瘤的一个切入点。本课题期望在已有的研究成果上,深入分析miRNA和恶性肿瘤之间包括表达、物质能量代谢等多方面的调控关系,为寻找新的肿瘤治疗靶点探明机制。第一部分：Ras信号通路对miRNA表达调控的研究目的：研究Ras信号通路对miRNA表达的调控作用及其分子机制。方法：以RAS蛋白转化的NIH3T3细胞和正常NIH3T3细胞为研究对象,利用microRNA芯片技术筛选两株细胞中差异表达的miRNAs,利用real-time PCR技术验证芯片结果。选出表达改变较为明显的6个miRNAs应用普通PCR和real-timePCR检测其不同结构体的表达水平。通过分析不同结构体的表达水平,寻找其差异表达的原因。通过构建包含miRNA基因启动子区域荧光报告载体分析：miRNA基因启动子活性,研究其受调控的可能分子机制。结果：①microRNA芯片筛选到大量差异表达的miRNAs;②real-time PCR验证芯片结果,挑选表达改变较为明显的6个miRNAs进行后续研究；③不同结构体表达水平的分析表明6个miRNAs受到了转录水平的调控；④启动子区域荧光报告载体荧光素酶活性分析获得有活性的启动子片段。结论：RAS蛋白转化的NIH3T3细胞中存在与正常NIH3T3细胞不同的miRNAs表达调控机制,使得miRNA发生了差异表达。第二部分：microRNA与肿瘤细胞谷氨酰胺代谢调控目的：通过研究谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)在大肠癌中的作用和表达调控机制,明确肿瘤细胞代谢异常的表观遗传基础,寻找干预治疗它的策略。方法：①用Western Blot技术检测大肠癌细胞中GLS蛋白表达情况；②应用GLS-siRNA敲除肠癌细胞系GLS蛋白表达后用MTS方法检测对细胞增殖的影响；③利用流式细胞仪检测GLS蛋白敲除后细胞凋亡情况及应用OAA/NAC后对凋亡的影响；④利用ATP检测试剂盒分析抑制GLS蛋白后细胞能量改变；⑤通过real-time PCR检测肠癌组织和细胞中miR-137表达情况；⑥用miR-137mimic敲除肠癌细胞系GLS蛋白表达后用MTS方法检测对细胞增殖的影响；⑦应用一个诱导APC蛋白表达引起内源性miR-137表达增强的细胞模型分析miR-137和GLS蛋白的靶标关系；⑧构建野生型和突变型pMIR-GLS-3’-UTR荧光报告载体直接证明miR-137和GLS蛋白的相互作用。结果：①Western Blot结果说明大肠癌细胞系GLS蛋白表达上调；②应用GLS-siRNA敲除肠癌细胞系GLS蛋白表达后用MTS方法检测其对细胞增殖有明显抑制作用；③流式细胞仪检测GLS蛋白敲除后细胞凋亡增多,应用OAA/NAC后凋亡有所减少；④ATP检测发现抑制GLS蛋白后细胞能量产生反而有所增多；⑤eal-time PCR检测肠癌组织和细胞中miR-137表达下调；⑥用(?)iR-137mimic敲除肠癌细胞系GLS蛋白表达后用MTS方法检测其对细胞增殖有抑制效果；⑦诱导APC蛋白表达后real-time PCR检测细胞内源性miR-137表达增强,Western Blot检测细胞GLS蛋白表达下降,应用miR-137inhibitor后发现GLS蛋白表达有所恢复,且MTS检测细胞增殖抑制也消失；⑧pMIR-GLS-3’-UTR荧光报告载体证明miR-137和GLS蛋白存在直接相互作用。结论：①GLS蛋白在大肠癌细胞中表达升高；②其表达升高可能和miR-137基因CpG岛甲基化引起的表达下调有关；③抑制GLS蛋白表达可以抑制大肠癌细胞的增殖,促进其凋亡,且凋亡可以被外源性草酰乙酸和N-乙酰半胱氨酸部分地抑制,说明谷氨酰胺代谢在大肠癌细胞的生长、增殖过程发挥了一定作用,但ATP产生没有相应降低,提示体外培养的大肠癌细胞对谷氨酰胺的依赖性并非那么强烈,可能很大程度需要葡萄糖供能。