发育性髋关节发育不良(Developmental dysplasia of the hip,DDH)是小儿骨科常见的先天畸形之一。发病率在不同的人群中有较大差异,在拉普人和美国土著人的发病率约为25～50‰,而非洲人群则明显降低。在我国发病率约为1.1～3.8‰,北方略高些。DDH作为一种常见的危害出生人口健康的疾病,其病因不清,认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。其中,遗传因素发挥主要作用,但目前DDH的致病基因尚未明确定位。前期,本课题组应用传递不平衡检验(Transmission disequilibrium test,TDT)方法,发现染色体17q21区域的D17S1820位点与DDH有关联,提示在该位点附近可能存在DDH的易感基因。因此,本研究中我们继续在D17S1820附近选择多个STR遗传标记,采用TDT方法,对DDH的易感区段进行定位;并选择该区域内可能与DDH的发生相关的基因,进行突变筛查及初步的功能研究,力争在分子水平揭示DDH的发病机制。方法本研究所涉及的DDH核心家系及正常对照儿童的外周静脉血均来自中国医科大学附属盛京医院小儿骨科。所有患儿均经临床及影像学确诊,畸形性髋脱位、神经源性髋脱位及综合征性髋脱位被排除在外。所有外周血的留取均已征得家长的同意,并告知用于科学研究的目的。本课题的研究已经中国医科大学附属盛京医院医学道德伦理委员会的批准。根据等位基因的数目(≥5)、杂合度(≥0.70)及多态信息含量(PIC≥0.5),在D17S1820附近选择了11个STR位点,采用PCR-毛细管电泳的方法,对103个DDH核心家系的309名成员进行基因分型,并进行TDT检验。同时,在100名正常人中,对有意义的STR位点进行群体遗传学分析,计算其等位基因频率、基因型频率、杂合度的观察值和期望值及多态信息含量,并进行Hardy-weinberg平衡检验。以评价所选用的STR位点在中国东北汉族人群中是否达到了遗传平衡,为以后的疾病关联分析奠定基础。二、COL1A1基因转录调控区突变筛查选择上述已定位的区域内,可能与DDH的发生相关的COL1A1基因作为候选基因,对其转录起始点上游1060bp(-1024～+36bp)的片段设计4对引物,在109个DDH患儿中分别进行PCR扩增,扩增产物直接测序。有基因变异的患儿,对其父母及100个正常儿的该段启动子也进行PCR扩增、测序,以确定变异位点的性质。三、COL1A1基因启动子区突变对其表达的影响通过上述基因突变筛查,检测到了COL1A1基因转录调控区-106位碱基存在C→T杂合突变。为进一步明确该突变在COL1A1基因转录调控水平的作用,采用定点突变的方法,构建了COL1A1基因启动子的野生型和突变型荧光素酶报告基因表达载体,转染成纤维细胞,通过比较表达的荧光素酶活性,明确该突变在转录水平对COL1A1基因表达的影响。1、PCR扩增正常人COL1A1基因转录起始点上游-1024～+36bp的启动子序列,片段长度为1060bp。2、经T/A克隆,连接酶切位点,再连接到PGL3-basic载体,得到野生型的PGL3-COL1A1表达载体。3、再采用定点突变的方法,把-106位碱基的C突变成T,再连接到PGL3-basic载体,构建突变型的PGL3-COL1A1表达载体。4、用构建好的两种表达载体及PGL3-basic分别瞬时转染NIH 3T3细胞。细胞培养48小时后,测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性,以明确COL1A1启动子区-106位碱基C→T突变对基因转录调控的影响。结果一、17q21区域DDH易感基因的定位(一)正常人群STR位点多态性分析100名无血缘关系的个体中,在D17S810位点只检测到两个等位基因;在D17S931位点,虽然检测到了7个等位基因和9种基因型,但其杂合度仅为41.13%,多态信息含量仅为0.3816,这两个位点不能提供足够的多态信息。其余9个STR位点的多态信息含量均在0.5以上,具有良好的多态性。同时,经X~2检验,各位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律,表明这些位点在我国东北汉族人群中达到了遗传平衡。其中,多态性最好的是D17S806和D17S787两个位点,在这两个基因座分别检测到18和10个等位基因,它们的期望杂合度分别为0.87和0.8038,PIC分别为0.8961和0.8189,具有极高的多态信息含量。因此,D17S806和D17S787这两个基因座是在东北汉族人群中进行疾病的连锁分析、基因定位等研究最理想的遗传标记。(二)TDT检验结果D17S810和D17S931因不能提供充足的多态信息,未进行TDT检验。其余9个STR多态位点在103个核心家系中的基因型分析结果符合孟德尔遗传模式。TDT检验结果显示,位于两端的D17S1787和D17S787与DDH不存在传递不平衡,而D17S855、D17S858、D17S806、D17S1877、D17S941、D17S752及D17S790与DDH均存在传递不平衡。因此,把DDH易感基因的区域初步定位于D17S855～D17S790之间的约11.70Mb的范围内。二、COL1A1基因转录调控区突变筛查在第67号家系患儿(67A)的-35位碱基检测到了c→T杂合变异(C/T基因型)。同时对100例正常人进行测序,也发现一例相同变异(N-91)。经网上基因数据库检索,未发现在该位点存在己知多态,证明在COL1A1的-35位碱基的C→T杂合变异为新发现的多态位点,可能与DDH的发生无关。在第3号和第69号家系中的患儿(3A、69A)的第-106位碱基检测到C→T杂合变异,同时对100例正常人进行测序,未发现相同的变异。经网上基因数据库检索,未发现该位点有已知多态。证实COL1A1基因转录调控区-106位碱基的C→T杂合变异为DDH核心家系中新发现的突变,该突变可能与DDH组织中COL1A1呈低表达有关。三、COL1A1基因启动子区突变对其表达的影响PCR扩增的目的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,各产物的片段长度与预期均相符合。构建的野生型和突变型PGL3-COL1A1表达载体,经测序鉴定,基因序列及突变位点与预期的完全一致,证实载体构建成功。经瞬时转染,细胞培养,荧光素酶活性测定结果显示,在转染野生型PGL3-COL1A1表达载体的细胞组,荧光素酶的相对活性为3.8665,为阴性对照组(PGL3-basic)的4.8倍;转染突变型PGL3-COL1A1表达载体的细胞组,荧光素酶的相对活性为1.3917,为阴性对照组的1.7倍。COL1A1基因启动子-106位碱基C→T突变后,其转录活性较野生型降低了64%,从而证实该点突变在转录水平抑制了COL1A1基因的表达。结论1、17号染色体(17q21.31～17q22)的D17S855～D17S790之间的区域与DDH有关联,在该区域内可能存在DDH的易感基因。2、在部分DDH患儿中,COL1A1基因转录起始点上游的-106位碱基存在C→T杂合突变。3、COL1A1基因转录调控区-106位碱基的C→T杂合突变,对启动子的转录活性起到了抑制作用;该突变是DDH患儿关节囊及圆韧带组织中COL1A1呈低表达的原因之一。