苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种革兰氏阳性土壤细菌,在孢子形成过程中,可以产生杀虫晶体蛋白,又称δ-内毒素,这些毒素对靶标昆虫具有严格的专一性。目前,已有几种表达Bt基因的转基因作物如Bt棉花得以商业化种植,有关Bt作物对(?)靶标生物的影响主要集中在陆地生态系统,但转Bt基因作物中的Bt蛋白质可通过根际分泌,花粉散布和收获后的作物残留物的扩散,实现从陆地生态系统到水生生态系统的转移。因此,评价Bt蛋白对水生生态系统的潜在风险显得尤为重要,但目前有关转Bt基因作物对水生生物的研究很匮乏。小球藻、大型蚤和两栖蛙类是稻田间常见的水生生物,代表了食物链上浮游植物、浮游动物和大型脊椎动物这3个不同的营养级。本研究以Cry1Ca纯蛋白、转cry1Ca基因抗虫水稻(T1C-19)、转cry1Ab/1Ac基因抗虫水稻(HH1)及其亲本对照明恢63(MH63)为研究材料,通过一系列室内外试验研究其对上述3种代表性水生生物的影响研究,评价转Bt基因水稻种植的环境安全性。主要研究内容和结果如下：1) Cry1Ca纯蛋白对蛋白核小球藻生长的影响：通过蛋白核小球藻三代试验,研究Cry1Ca纯蛋白对小球藻的生长影响。按照0,10ug/L,100ug/L,1000ug/L4个浓度梯度向初始密度为5.4×105个/ml的藻液中添加Cry1Ca杀虫毒蛋白,培养7d后,取出50m1藻液,转接至下一代,再次添加相同浓度的Cry1Ca杀虫毒蛋白,每天测定藻液密度,试验共培养三代小球藻,测定每一代藻体及上清中Cry1Ca蛋白含量。同时,为了了解Cry1Ca蛋白在藻体及培养液中分布的规律,在无菌条件下将小球藻接种至水生4号人工培养液预培养7d,小球藻密度达到4.8×106个/ml,按1000ug/L浓度添加Cry1Ca毒蛋白,测定每24h的藻泥及上清中的毒蛋白含量。结果显示：①第一代对照组小球藻在0-7d时间内呈线性生长关系,10,100,1000的Cry1Ca蛋白暴露组的小球藻生长曲线与对照组几乎重叠,四个处理的小球藻密度在Do到D7间均无显著差异(p>0.05)。第二代、第三代的结果与第一代结果完全一致。②Cry1Ca蛋白在小球藻藻体和培养液中随时间推移迅速降解。2)转Cry1Ca基因水稻秸秆浸出液对蛋白核小球藻生长的影响：试验向小球藻培养液添加了不同浓度梯度的Cry1Ca纯蛋白(10,100和1000μg/l)和T1C-19及其亲本对照(MH63)水稻秸秆浸出液(5,10,20,40和80%),以检测小球藻是否可以吸收Bt蛋白以及不同浓度的水稻秸秆浸出液对小球藻生长、保护酶活性的影响。结果显示：①T1C-19水稻秸秆处理组的小球藻生长速率依次为5%>10%>20%>control>40%>80%,MH63处理组小球藻生长速率依次为5%>10%>control>20%>40%>80%,但20%T1C-19组、20%MH63组和对照组在第8d细胞数上统计差异不显著(p>0.05)；②培养7d后,在各T1C-19处理组的小球藻内均检测到了Cry1Ca蛋白,而在T1C-19处理组的培养液和MH63处理组的培养液和小球藻中几乎均未检测出Cry1Ca蛋白。3)转cry1Ca基因水稻对大型蚤生殖毒性影响：以大型蚤作为实验生物,研究了500μg/L,250μg/L,125μg/L不同浓度的Cry1C蛋白对大型蚤7d生长实验和21d繁殖实验。同时,以转基因水稻稻谷为食物来源,设置对照,T1C-19组和MH63组,观察饲喂转基因水稻稻谷对大型蚤F0和F1代生长繁殖的影响。结果显示：①7d生长试验结果显示Cry1Ca蛋白对大型蚤的死亡率,体重,体长,体宽,刺长均无显著影响(p>0.05)；②21d繁殖试验结果显示500μg/L的Cry1Ca蛋白对大型蚤的生长和繁殖指标有显著影响(p<0.05),此剂量效应结果有待进一步确认；③饲喂稻谷组的第一代(Fo)和第二代(F1)大型蚤饲养21d后其生长和繁殖性能均显著小于对照组,但T1C-19和MH63稻谷组间无显著性差异(p>0.05)。4) Cry1Ca蛋白和含稻谷的饲料,对爪蟾蝌蚪和幼体的影响：通过向蝌蚪饲养水体中添加不同浓度Cry1Ca纯蛋白和水稻秸秆浸提液以及饲喂爪蟾幼体含T1C-19水稻稻谷的饲料,来研究T1C-19水稻对爪蟾生长发育的影响。结果显示：①从爪蟾蝌蚪发育至完全变态, Cry1Ca纯蛋白100μg/L组和Cry1Ca纯蛋白10μg/L组的存活率、体重、体长、发育时间、脏器重以及肝脏酶活性等检测指标均与空白对照组基本一致,无显著差异(p>0.05)。②虽然T1C-19和MH63水稻秸秆浸出液组的一些检测指标与对照组差异显著(p<0.05),但是T1C-19和MH63两组间差异不显著(p>0.05)。③幼蟾取食含T1C-19水稻稻谷的饲料90d,其死亡率、体重、日增重、肝重和脂肪体体重均无显著影响,未见试验动物出现明显中毒症状,大体解剖未见异常病理改变,此外,胃、肠道、肝、肾及性腺等重要组织器官的显微结构也未出现异常现象。5)转Cry1Ab/Ac基因水稻种植对稻田蛙类的影响：评价转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻(华恢1号,HH1)种植对稻田蛙类的安全性影响。试验分HHl未喷洒农药组、亲本明恢63(MH63)未喷洒农药组、HH1喷洒农药组、MH63喷洒农药组4个处理,每个处理设置3块试验田,定期调查不同处理田块内的蛙类蝌蚪数量,并检测大田中不同时期采集到的成蛙和蝌蚪消化道及其内容物Bt蛋白含量。此外,在每块试验田中设置围网,人工放养黑斑蛙幼蛙,研究4种处理对黑斑蛙存活率、体重、食性以及各器官的组织学影响。结果显示：①“是否转入Bt基因”对稻田中的蝌蚪数量以及所放养的黑斑蛙体重变化没有显著影响(p>0.05),而农药的施用会导致蝌蚪在短时间内死亡,同时会显著影响黑斑蛙幼蛙的生长(p<0.05)。②转基因水稻种植块中的黑斑蛙偏向取食蜘蛛等非靶标昆虫,但取食的差异并未引起其各器官的组织学变化。③在稻田中采集到的192个青蛙样本中均未检测到Cry1Ab/Ac蛋白。转基因抗虫水稻的种植对以上3种代表性水生生物——小球藻、大型蚤和蛙类未见产生负面影响。但转基因作物的长期种植,所产生的Bt蛋白残留,是否会产生累积效应,仍需进一步深入研究。