猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,其特征是孕前期受到感染,经胎盘使胚胎受到侵袭,引起初产母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等,同时还可以引起仔猪的皮炎和腹泻,其它类型的猪感染后无明显临床特征。猪细小病毒病存在于世界各地并在大多数猪场流行,严重影响着养猪业的发展,因此本病一直是猪病研究的热点之一,PPV又常同猪伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害。近年来,PPV感染呈扩大上升的趋势,给全球养猪业带来巨大的经济损失。所以,加强对PPV的检测、监测及预防十分紧迫。目前,猪细小病毒病诊断方法主要有:病毒分离、血凝抑制试验和乳胶凝集试验等检测方法,其中血凝抑制实验相对简便,但由于要制备豚鼠红细胞以及被检血清必须经高岭土或其它方法处理而显得麻烦;乳胶凝集试验的灵敏度不高,尤其是对隐性感染动物往往漏检;病毒分离和鉴定结果准确可靠,但是该方法费时费力,并且需要一定的技术条件和设备;聚合酶链式反应(PCR)及荧光定量PCR诊断具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点成为诊断猪细小病毒的研究热点。为此,我们进行了以下研究:1.利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEM T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合症病毒,猪圆环病毒,猪乙型脑炎病毒,猪伪狂犬病毒,猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PPV感染的检测。2.将猪细小病毒HN1株接种于PK-15细胞,用荧光定量PCR方法研究了猪细小病毒增殖的基本特征与规律。结果发现在PK-15细胞中,病毒在接种后3小时开始增殖,在12-48小时增殖最为迅速,在48小时病毒达到增殖最高峰;研究还发现在24小时病毒开始加速释放,72小时达到最高峰。该结果为疫苗生产提供了试验基础,同时也为研究猪细小病毒病理学研究提供了试验基础。3.猪精液中含有高浓度的蛋白质,因此提取高纯度DNA较为困难;试验分别用水煮法、异硫氰酸胍法和Trizol法三种方法对连续稀释梯度猪精液提取猪细小病毒DNA,应用SYBR Green荧光定量PCR技术评价提取效果并加以对比。结果发现Trizol法可以提取出高纯度的DNA,但因Trizol试剂价格昂贵,不适用临床检测;比较另外两种方法,水煮法较异硫氰酸胍抽提法更为有效,是一种迅速、简便、经济、高效的DNA提取方法,适合于临床大量样品的检测。