论文部分内容阅读
菊苣为菊科多年生草本植物,广泛分布于世界各地,是目前国内外广泛应用的主要饲草和蔬菜之一。菊苣体内含有多种重要的物质如倍半萜烯、内酯、内酯苷、黄酮类、香豆素、花色素甙、有机酸和细胞激肽类等,菊苣虽然营养丰富,但是蛋白质含量低。植物蛋白是包括人类在内的动物界所消耗蛋白质的主要来源。然而,作为日常蛋白质的主要来源,植物蛋白因缺乏某些人体必需氨基酸而营养不够平衡。一般来说,禾谷类蛋白质的赖氨酸含量较低；豆类和蔬菜蛋白质则缺乏含硫氨基酸,如蛋氨酸和半胱氨酸。含硫氨基酸在有效改善奶制品、肉类以及羊毛产量等方面起着决定性的作用,并可增加牲畜的重量。利用基因转化技术可以提高菊苣中含硫氨基酸的含量,改善菊苣品质。本研究在建立菊苣高频再生体系和遗传转化体系的基础上,将构建的植物表达载体pCMBIA1302-γ-zein和pCMBIA1302-zeolin通过农杆菌介导法转入菊苣中,获得抗性植株,对抗性植株进行了分子检测和表达定位研究.表明外源基因已整合进菊苣基因组中,并得到表达,为菊苣分子育种提供了基础材料和理论依据。主要研究结果如下：1、研究了培养基、基因型、外植体和激素等因素对菊苣再生的影响,建立了菊苣稳定高效再生体系：普那菊苣真叶在MS培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IBA的激素组合,能得到98.92%的愈伤诱导率,在相同培养基中分化率达到93.74%,平均每个外植体的分化芽数达到19.46个,分化芽在添加0.1 mg/L NAA的1/2 MS培养基中,生根率达到98.77%,炼苗后成活率达95%以上。2、利用RAPD分子标记技术研究了体细胞无性系的遗传稳定性。从12条引物中筛选出2条RAPD引物对15个来自同一叶片一次和二次体细胞再生的植株和原供体植株DNA进行检测,结果表明菊苣一次直接体细胞再生后代没有体细胞无性系变异,二次再生植株中有1株发生了1条DNA多态性差异,说明本研究建立的经一次组织培养获得的再生植株遗传稳定,不易发生体细胞无性系变异,可用于遗传转化。3、通过克隆载体pMD18-T的介导,将γ-zein和zeolin基因与质粒pCAMBIA1302相连,构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pCM-γ-zein和pCM-zeolin,该载体含有hpt选择标记基因,并将该载体导入农杆菌LBA4404中,为遗传转化奠定了基础。4、建立起菊苣遗传转化筛选系统：共培养结束后,转化体在无hyg的预培养基上延迟培养1-2d,在愈伤培养和芽分化阶段添加25mg/L hyg;抗性芽扩繁阶段添加15mg/L hyg,生根阶段添加10mg/L hyg。农杆菌介导转化时以头孢霉素(Cef)为抑菌剂,愈伤培养和分化阶段添加500mg/L,植株再生阶段添加250mg/L。5、采用正交设计,利用叶盘转化法,对影响农杆菌介导菊苣遗传转化的预培养时间、农杆菌菌液浓度、浸染时间、共培养乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养pH等因素进行了优化,以抗性率为指标,确定了农杆菌介导菊苣叶片转化的适宜条件为：预培养时间为2d,农杆菌悬浮液OD600值为0.4Abs,感染时间10min,共培养基pH值5.4～5.8,共培养时间3d,共培养基中添加100umol/L的AS,通过以上研究,构建了农杆菌介导菊苣叶片的遗传转化体系。用γ-zein和zeoin基因对该优化体系验证结果表明,两基因的Hyg抗性芽发生率平均为13.52%,比基本转化条件下的2.95%提高了3.58倍,证明了优化的参数能大幅度提高转化效率。6、对获得的抗性植株进行PCR检测、PCR-Southern、Dot blot、Southern杂交分析、RT-PCR检测、离体叶片潮霉素抗性鉴定,表明外源目的基因随机整合进菊苣基因组中,并在RNA水平上得到了转录。7、对转γ-zein基因的阳性植株进行了激光共聚焦显微镜定位观察,结果表明：转化的γ-zein基因主要在转基因菊苣表皮的细胞核中和根尖细胞膜上进行了表达。8、本次实验共获得14株转γ-zein基因的阳性植株,阳性率为42.42%,转化率为5.6%,12株转zeolin基因的阳性植株,阳性率为46.15%,转化率为6.38%。