背景:肺癌的发病率与死亡率高居所有癌症之首。大多数肺癌(~80%)为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),每年导致至少150万人死亡。NSCLC的高发生率、高死亡率、高转移性、严重的并发症、生存周期短和治疗过程中给患者造成的生理和心理的伤害,都迫切的催促着人们探究NSCLC发生发展的分子机制,寻找建立新的治疗策略的有效靶标。CD300a是在骨髓和淋巴谱系中表达的I型跨膜蛋白,并通过其抑制能力调节免疫应答。CD300a具有免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)V样细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质尾部。有趣的是,CD300a的基因位点是基因组中仅有少数位于强阳性进化选择下的位点之一,这可能表明该受体家族在免疫调节中的重要性。目前,已经确认CD300a在多种免疫细胞类型中发挥抑制性受体的作用。人CD300a与mAb的交联响应于由B细胞受体(B-cell receptor,BCR),T细胞受体(T-cell receptor,TCR),FceRI和FcgRIIa介导的刺激而抑制Ca2+动员。它还抑制NK细胞介导的细胞毒性,B细胞增殖,IgE依赖介质从肥大细胞释放,干细胞因子(Stem cell factor,SCF)介导的肥大细胞活化、分化和存活,以及嗜碱性粒细胞中IgE介导的CD63表达,嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的嗜酸性粒细胞迁移和IL-5和GM-CSF诱导的嗜酸性粒细胞存活,FcgRIIa介导的嗜中性粒细胞产生的活性氧物质,LPS和CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG)诱导的髓单核细胞THP-1和U937细胞分泌IL-8。CD300a也参与病毒用于发展免疫逃避策略和感染宿主细胞的机制。CD300a在病毒感染过程中的参与包括脂质依赖性和非依赖性机制,具体来说,病毒通过各种方式将磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)覆盖在其表面,模拟凋亡细胞和碎片。众所周知,外源化PS对于专职(例如巨噬细胞)和非专职吞噬细胞的凋亡细胞清除至关重要。而有报道表明,CD300a可以作为PS结合蛋白参与病毒进入宿主细胞的过程。类似于,CD300a通过PS和PE结合凋亡细胞,并传递抑制信号,阻止单核细胞衍生的巨噬细胞(Monocyte-derived macrophages,MDM)吞噬死细胞。此外,在天然表达CD300a的MDM中用抗体(Abs)阻断受体导致感染细胞数量的减少。除了与PS和PE相关的病毒颗粒结合外,还已经证明CD300a能够以PS和PE非依赖性方式结合并促进病毒的进入。目前在大规模蛋白质相互作用筛选中,鉴定并验证了几种人腺病毒E3蛋白和宿主细胞的相互作用。其中,人类腺病毒-D47E3/49K蛋白结合CD300a和CD300c配对受体。CD300a和CD300c配对受体的胞外结构域具有广泛的同源性,但细胞内结构域决定了它们的抑制和激活功能。CD300a也参与病毒逃逸机制,例如抑制NK细胞介导的针对感染细胞的细胞毒性。或在慢性HIV-1感染期间,参与T细胞衰竭。在过去的几年中,越来越多的证据表明,CD300a所在的受体家族参与了许多疾病的发病机制。例如,CD300a在肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞上的表达,参与了这3种重要细胞类型启动和调节的过敏反应,因此设计靶向CD300a的双特异性抗体片段以及其他受体,目的是下调这些功能。除了在过敏过程中的作用外,目前还已知小鼠盲肠结扎和穿刺腹膜炎模型中肥大细胞在发挥重要作用,大量细胞在腹膜腔内发生细胞凋亡。盲肠结扎和穿刺后,CD300a缺陷的腹膜肥大细胞产生更多的化学引诱物,导致中性粒细胞募集和更好的细菌清除。因此,CD300a2/2小鼠显示出延长的存活期。这些结果表明CD300a调节肥大细胞对微生物感染的炎症反应。CD300a与3种其他基因一起,已被提议作为基于血液的生物标志物,可用来以区分溃疡性结肠炎与克罗恩病和非炎症性腹泻。这可能有助于目前基于对细菌抗原的反应性的炎症性肠病的血清学检测。其他遗传相关性研究表明,CD300a可能与阿尔茨海默病的病因有关。目前,据我们所知,有四项研究报道了CD300a在肿瘤中发挥的作用。Jiang等人发现CD300A mRNA水平与弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)患者的总生存时间呈负相关。降低CD300a在OCI-Ly01,Farage和SUDHL-4细胞中的水平显著抑制了细胞增殖,但并没有影响VAL、OCI-Ly10,或SUDHL-8细胞的增殖。此外,异种移植动物模型也表明OCI-Ly01和Farage细胞中CD300a水平的降低显著抑制了体内肿瘤形成。在分子机制上发现,CD300a的表达降低导致AKT磷酸化显著减弱,而这是OCI-Ly01、Farage和SUDHL-4细胞中肿瘤发生的关键分子事件。Smith等人为了确定急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)中MRD(Minimal residual disease,MRD)检测的新标记,比较了270例新诊断儿童ALL患者的淋巴母细胞全基因组表达与正常CD19?CD10?B细胞祖细胞全基因组表达,鉴定了CD300a与其他标志物在ALL中的差异表达。在包括CD300a的16种差异表达标志物中,对包括抗CD19、CD10和CD34 MRD检测,并通过4色流式细胞仪分析验证其为新的标志物之一。最新的研究发现CD300a在急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)中显著高表达,并且与预后相关。CD300a表达的降低促进了细胞凋亡,并抑制了AML细胞系U937的增殖和迁移,以及促进了AKT/mTOR途径的活化。这些结果证明CD300A在AML细胞中作为肿瘤启动子起作用。为此我们猜想是否CD300a在实体肿瘤中进展中同样存在影响。在本研究中,我们首次发现了CD300a在病毒感染和细胞免疫过程之外—NSCLC的发病与发展过程中的作用。这些结果提示我们,CD300a仍具有很多我们未知的非常关键的功能,值得我们继续深入的研究。方法:利用GEPIA中483例肺腺癌(LUAD)样本和347例癌旁组织的RNA数据,以及486例肺鳞状细胞癌(LUSC)样本和338例癌旁组织的RNA数据,分析CD300a mRNA在NSCLC中的表达变化。随后,我们收集了23例NSCLC患者的肿瘤临床样本和相对应的癌旁正常组织以及他们的血清样本,并募集了23名健康志愿者,同样收集了他们的血清样本。利用qRT-PCR技术,我们检测了CD300a在这些组织和血清样本中的mRNA表达水平。我们利用GEPIA对CD300a高表达和低表达的患者进行生存期的分析。随后,在细胞水平上,选用NSCLC细胞系A549和H1650作为体外研究细胞模型,通过分别转染siRNA-CD300a和pcDNA3.1-CD300a,构建CD300a敲低(KD)和CD300a过表达(OV)细胞株。利用CCK8实验和克隆形成实验检测CD300a过表达或敲低对细胞增殖和生长的影响。使用Transwell实验探究CD300a表达上调或下调对细胞迁移的影响。通过流式细胞术检测CD300a过表达或敲低对细胞凋亡的影响,并通过weatern blot检测凋亡相关蛋白的表达变化。最后,深入探究CD300a在NSCLC细胞中发挥作用所涉及的信号途径。在体内动物实验模型中,分别构建CD300a敲低(KD)、CD300a过表达(OV)以及它们相对应的阴性对照(NC-KD和NC-OV)的裸鼠异种移植瘤模型。每隔3日,测量并记录移植瘤的体积,随后绘制肿瘤生长曲线;在18天后,处死裸鼠,取出移植瘤,使用TUNEL染色法检测肿瘤组织内的细胞凋亡情况。结果:GEPIA分析结果表明CD300a mRNA在NSCLC中表达显著下调(P<0.05)。我们收集到的临床样本检测结果表明,相比于癌旁正常组织,CD300a在NSCLC肿瘤组织中的mRNA表达被明显下调(P<0.001)。该结果与GEPIA分析结果一致。血清样本中CD300a的mRNA水平分析结果表明,相比于健康志愿者,CD300a在NSCLC患者血清中的mRNA水平明显下调(P<0.001)。CD300a在NSCLC患者血清中的mRNA表达趋势与其在肿瘤组织中的表达趋势一致。并且发现,CD300a的表达水平与NSCLC患者的预后显著相关(P=0.029)。相比于CON组细胞,OV组A549和H1650细胞在被转染pcDNA3.1-CD300a 24 h和48 h后,在450 nm处的吸光度值并没有明显变化;但在转染72 h后,吸光度值明显减少(P<0.05)。而相比于CON组细胞,CD300a敲低后对吸光度值没有显著影响(P>0.05)。克隆形成实验结果与CCK8实验结果一致,结果发现与CON组相比,CD300a过表达显著降低了A549和H1650细胞的克隆数以及形成克隆的大小(P<0.01)。而CD300a敲低对细胞形成克隆的数量和大小并没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比,CD300a过表达的A549和H1650细胞的迁移细胞数分别降低至约1/2和2/3(P<0.05);CD300a敲低的A549和H1650细胞的迁移细胞数分别增多约1.7倍和1.3倍(P<0.05)。与阴性对照组相比,CD300a过表达的A549细胞的凋亡率由8.78±0.95%显著增多至27.45±4.63%(P<0.01);CD300a过表达的H1650细胞的凋亡率也由11.97±1.45%明显增多至19.13±3.56%(P<0.01)。与此相反,CD300a敲低的A549和H1650细胞的凋亡率分别降至3.50±0.47%和5.67±0.75%(P<0.05)。与对照组相比,CD300a过表达的A549和H1650细胞中的关键抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下调,而在CD300a敲低细胞中Bcl-2的表达上调(P<0.05)。同时,当CD300a在A549或H1650细胞中表达上调时,Bax和Caspase3 p17(关键促凋亡蛋白)的表达显著增加;当CD300a被敲低时,Bax和Caspase3 p17的表达相应减少(P<0.05)。我们还观察到与对照组相比,CD300a过表达组Wnt3和β-catenin的表达显著降低(P<0.05)。当CD300a在A549和H1650细胞中的表达上调时,下游蛋白E-cad(一种关键细胞粘附相关蛋白)的表达相应增加(P<0.05)。另外,CD300a的敲低导致A549和H1650细胞中Wnt3和β-catenin表达的增加以及E-cad表达的显著降低。在裸鼠异种移植瘤模型上的实验结果也与细胞实验结果基本一致。随着时间的推移,NC-OV组和NC-KD组的裸鼠皮下异种移植瘤体积持续增长,从最初的0.2cm~3增长至1.07±0.14 cm~3(第18天),两组之间无显著性差异。而自异种移植瘤接种后,OV组裸鼠皮下异种移植瘤体积一直小于NC-OV组移植瘤的体积;并且,在接种18天后,体积大小存在显著性差异(0.75±0.08cm~3 VS.1.07±0.14 cm~3,P<0.05)。与CD300a过表达对移植瘤生长的影响不同,CD300a敲低并没有影响移植瘤的生长。该结论由KD组裸鼠皮下异种移植瘤体积与NC-KD组之间并不存在显著性差异可以得出。最后,TUNEL染色结果表民,与NC-OV组相比,OV组裸鼠移植瘤组织的凋亡明显增多。而与NC-KD组相比,KD组裸鼠移植瘤组织的凋亡并没有显著变化。结论:本研究发现CD300a在NSCLC中异常低表达,并可以作为潜在的预测指标。CD300a低表达预示了预后不良。此外,我们发现CD300a可能通过抑制Wnt/β-catenin途径在NSCLC进展中发挥抑癌作用,调控NSCLC细胞的生物学功能。