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能源危机席卷全球,寻找替代能源势在必行。氢能以其来源丰富、重量轻、贮能高、燃烧产物是水等优点成为备受关注的新型能源。光合细菌(photosynthetic bacteria,PSB)是一类能进行光合作用并产生氢气的细菌,深红红螺菌(Rhodospirilum rubrum)属于兼性厌氧菌,是光合细菌的模式菌株,具有非常重要的研究价值。此外,光合细菌还能分解多种有机物。光能利用,产氢和处理有机废物、废水结合于一体的特性,使光合细菌显示出了巨大的研究价值。转座子作为遗传学研究的重要工具,能够插入基因组中造成插入突变。利用转座子进行菌株诱变,能够得到较稳定的突变株。并且通过一定的方法,获得侧翼序列,将有利于在分子水平上对产氢机制进行深入的探讨。
二氯化钯(PdCl2)溶液能与氢气等还原性气体发生反应而析出黑色的金属钯。本研究据此设计了一种快速筛选高产氢光合细菌突变株的方法。即在96孔深孔培养板中培养光合细菌并使其产氢,用浸润PdCl2的脱脂棉片封盖,以观察对应孔的棉片颜色变化程度来筛选高产氢的突变株。本研究利用转座子构建了光合细菌Tn5随机插入突变库,并应用此法在其中进行了筛选,对选出的高产氢突变株进行发酵,用气相色谱检测其产氢情况,结果发现两种方法得出的结论并不一致,对此情况进行了讨论,提出了改进的方法,为快速筛选高产氢菌株方法的建立打下了坚实的基础。
本研究中,筛选得到一株高产氢菌株R.rubrum RM4。在持续光照条件下,产氢量是出发菌株的1.89倍。利用转座子上携带复制起始点的特点,将高产氢突变株基因组用BamH I进行消化、自连接、转化到大肠杆菌中,并利用转座子引物进行测序,从而得到转座子侧翼序列。经比对,发现转座子插入破坏的基因为丙二酰-CoA脱羧酶(Malonyl-CoAdecarboxylase)。目前,并没有相关文献说明此酶与光合细菌产氢有联系,所以很可能存在其他突变位点。