萘酰亚胺衍生物TZY2抑制肝癌的分子机制研究

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实验目的:本论文以本实验室合成的新的萘酰亚胺衍生物TZY2为研究对象,利用肝癌细胞SMMC-7721和Hep G2细胞模型和荷瘤小鼠动物模型,探讨TZY2体内外的抗肝癌作用及作用机制。实验方法:MTT实验检测TZY2对肝癌SMMC-7721细胞和Hep G2细胞增殖的影响。AO/EB染色后采用高内涵成像系统观察细胞的形态学变化;Annexin V/PI双染后采用流式细胞仪分析TZY2对细胞凋亡的影响;PI单染后采用流式细胞仪分析TZY2对细胞周期分布的影响;Rh123染色后分别采用高内涵成像系统和流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;以DCFH-DA为荧光探针,采用高内涵成像系统检测细胞内活性氧含量的变化。采用细胞划痕实验观察TZY2对肝癌细胞迁移的影响。采用Western Blot实验检测TZY2作用于Hep G2和SMMC-7721细胞24 h、48 h后,对PARP-1、Caspase-8、Bcl-2、p53等相关蛋白表达的影响。采用昆明小鼠H22腋下实体瘤、H22肺转移以及BALB/c小鼠结肠癌CT-26肺转移三种荷瘤动物模型研究TZY2对实体肿瘤生长以及肺转移的影响。实验结果:TZY2剂量依赖性的抑制肝癌细胞SMMC-7721和Hep G2细胞的增殖,48 h的IC50分别为(3.3±1.01)μM、(8.75.±0.74)μM。AO/EB染色、Annexin V/PI双染和Rh123染色实验均表明TZY2能够诱导SMMC-7721细胞和Hep G2细胞凋亡和线粒体膜电位下降,且呈时间和浓度依赖性。Western Blot结果表明TZY2激活p53、PARP-1、Caspase-8、Caspase-3,上调Bax的表达及下调Bcl-2的表达,并促进cytochrome C从线粒体释放到细胞浆。此外,TZY2抑制细胞的迁移能力并下调β-catenin的表达。昆明小鼠H22腋下移植实体瘤和H22肺转移实验均显示TZY2可以抑制肿瘤生长和肺转移,抑制率分别是48.99%和61.80%。此外,TZY2抑制CT-26细胞的肺转移,转移抑制率为63.92%。实验结论:TZY2体内外均具有较强的抑制肝癌细胞增殖和转移的作用,该作用与TZY2诱导细胞凋亡及下调β-catenin的表达有关。
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