肿瘤的发生是由多种基因参与、经过多个步骤、多种阶段变化的过程。已发现有许多癌基因、抑癌基因、错配修复基因及黏附因子等对肿瘤的生成及发展有直接影响。肿瘤的转移也是复杂的过程，很多基因结构及功能的变化起了重要的作用。RASSF1是一个抑癌基因，在肺癌和乳腺癌细胞株3号染色体短臂（3p21.3）位点克隆出来的。RASSF1基因有三个主要的转录本（transcript），即RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C。研究表明，RASSF1A在所有的正常组织中均表达，但是在胃癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌等绝大多数肿瘤中却表达缺失。转录本RASSF1B主要在造血系统细胞中表达，其在正常组织和肿瘤组织中表达相近。Ras基因是一种癌基因，包括H-ras、K-ras和N-ras。它们分别定位于不同的染色体片断上，与细胞内信号传递、细胞增殖及分化有关。Ras基因激活与人类许多恶性肿瘤发生有密切关系，其主要激活机制是基因的点突变和过度表达。目前认为RASSF1表达失活主要与启动子区CpG岛特异的高甲基化、杂合性丢失及染色体缺失有关。研究证明在多种肿瘤细胞中，如：肺癌、乳腺癌、结肠癌及泌尿系肿瘤中有RASSF1A的缺失及高甲基化，胃癌中也有高甲基化的表达。研究还证实，RASSF1A的3号染色体短臂上存在多个位点的杂合性丢失（Loss of hererozygosity LOH）。本研究目的观察RASSF1A、RASSF1B在胃癌及胃良性病变中的表达缺失及甲基化程度，K-ras在胃癌及胃良性病变中的表达情况，以及与临床的关系，为研究胃癌的发病机理提供有价值的依据。实验材料方法1、材料选用沈阳军区总院2004年6月1日-2005年6月30日外科手术的胃癌患者癌组织及相应的癌旁组织（距癌旁边缘＞5cm）各32例。中国医科大学附属一院胃镜室2004年6月1日-2005年6月30日胃镜下活检标本共51例，包括浅表性胃炎30例，萎缩性胃炎21例。离体后迅速放入液氮中冻存，后转入-80℃冰箱保存备用。所有患者术前均未经放疗或化疗。其胃癌中，高分化腺癌12例，中分化腺癌9例，低分化腺癌11例。根据美国Medlin国立图书馆基因库检索基因全序列，电脑软件Primer 5.0版自行设计，RASSF1A、RASSF1B、K-ras、测定甲基化和非甲基化程度引物、半巢式引物由北京三博远志生物技术有限公司Primer合成。RT-PCR试剂盒、缓冲液、dNTP、Marker、一次性耗材、Tag-E，均购于TaKaRa大连宝生物公司。2、方法（1）组织标本总RNA的提取及cDNA合成严格按照Trizol Reagent试剂盒说明书提取组织总RNA，应用UV1201型（日本）紫外分光光度计测定RNA A₂₆₀、A₂₈₀值，计算RNA浓度及纯度。按照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成。将合成的终产物cDNA以1：4稀释后置-20℃保存备用。（2）聚合酶反应（PCR）测定RASSF1A、RASSF1B、K-ras在胃癌、癌旁组织及胃良性病变中的表达缺失情况。反应体积为25μl，取总cDNA 3μl，10Xbuffer 2.5μl，dNTP（2.5 mmol／L）2μl，Tag-酶0.2μl，上下游引物各0.1μl，DEPC水补齐至25μl。反应条件：循环参数：94℃预变性3 min后，94℃变性45sec，55.8℃1min，72℃延伸1 min，进行35个循环，最后72℃补延伸7 min。（3）饱和氯化钠法提取组织DNA组织标本约0.1g剪碎研磨，加入DNA裂解液，然后按照DNA试剂盒说明提取基因组DNA，用UV-1201型（日本）紫外分光光度计测定DNA浓度，浓度OD₂₆₀约等于1.65，-20℃保存备用。（4）基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰①碱变性：取5μgDNA（10μl）加3 mmol／L的NaOH 15.51μl，再加超纯水24.5μl，37℃放置15min。②硫化与脱氨：向碱变性的DNA中加入新鲜配制的3mmol／L亚硫酸氢钠（NaHSO₃ PH5.0）280μl和10mmol／L氢醌（C₆H₆O₂）15μl，以矿物油2滴覆盖液面，50℃保温放置16～20h。③纯化与脱硫：利用Wizard DNA纯化试剂盒纯化修饰后的DNA。加入3 mmol／LNaOH 5.5μl，室温下放置10～20min脱硫。④加入6 mmol／L乙酸钠（NH₄AC）40μl，再加预冷的无水乙醇沉淀DNA，以30μl超纯水溶解，-20℃过夜。（5） RASSF1A甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）共设计了2对引物，分别用来扩增RASSF1A基因启动子5’CpG位点处于甲基化（m）状态和未甲基化（u）状态的等位基因。RASSF1A-m-F 5’-GTG TTA ACG CGT TGC GTA TC-3’；RASSF1A-m-R 5’-AAC CCC GCG AAC TAA AAA CGA-3，扩增长度128bp，RASSF1A-u-F 5’-TTT GGT TGG AGT GTG TTA ATG TG-3’；RASSF1A u-R 5’-CAA ACC CCA CAA ACT AAA AAC AAA-3’，扩增长度109bp。PCR反应体积为25μl：取：DNA-Na 5μl，dd．H₂O13.3μl，10×buffer 2.5μl，dNTPs（2.5mmol／L）2μl，Tag酶（5u／μl）0.2μl，分别取RASSF1A-m上下游引物、RASSF1A-u上下游引物各1μl。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性60s，55℃60s，74℃延伸2min，共30个循环，最后一个循环74℃补延伸5min。取15μl上述PCR产物经2％琼脂糖浆凝胶电泳鉴定。电泳成像拍照并用Kodak 3.5专用软件进行图象分析。（6）序列测定随机选取2例胃癌标本，RASSF1A基因甲基化和未甲基化PCR产物，送北京三博远志生物技术有限公司测序仪测序分析。3、统计学分析采用x²检验和Fisher精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。结果用SPSS 9.0统计软件处理。实验结果一、胃癌组织及良性病变中RASSF1A、RASSF1B mRNA的表达缺失RASSF1A从胃良性病变到胃癌中的表达缺失率有逐渐增加趋势，RASSF1B从胃良性病变到胃癌中的表达缺失率无明显差异。见表1，见图1、2。注：#与癌旁组织及浅表性胃炎组比较P＜0.05，与萎缩性胃炎组比较P＞0.05二、RASSF1A、RASSF1B的表达与胃癌分化程度的关系RASSF1A、RASSF1B mRNA在高分化癌、中分化癌、低分化癌各组间表达缺失率比较无统计学意义。见表2。注：#胃癌各分化组之间比较P＞0.05三、K-ras在胃癌组织和胃良性病变中的表达K-ras从胃良性病变到胃癌中的表达阳性率有逐渐增加趋势。见表3。K-ras在高分化癌、中分化癌、低分化癌中阳性表达率各组间比较无统计学意义（P＞0.05）。注：#与癌旁组织及浅表性胃炎组比较P＜0.05，与萎缩性胃炎组比较P＞0.05四、MS-PCR法检测胃癌及胃良性病变中RASSF1A甲基化发生率及临床特征的关系胃癌发生甲基化率与癌旁组织及浅表性胃炎发生甲基化率之间比较差异有显著性（p＜0.01），其余各组之间比较差异无显著性。见图3。在胃癌病理组织分化程度中，各组间发生甲基化率比较差异无显著意义（p＞0.05）。胃癌中淋巴结转移组甲基化发生率为64％（16／25），无淋巴结转移组甲基化发生率42.8％（3／7），两组之间比较无显著差异。见表4。注：*与癌旁组织及浅表性胃炎组比较P＜0.05结论1、RASSF1A、RASSF1B在癌旁组织中的表达缺失率均为6.25％，从胃良性病变到胃癌中RASSF1A的表达缺失有逐渐增加的趋势，在胃癌组织中的表达缺失率分别为59.3％（19／32）和28.2％（9／32），说明RASSF1A在胃癌的演变过程中有逐渐缺失表现。RASSF1B从胃良性病变到胃癌中的表达缺失率无明显差异。2、RASSF1A、RASSF1B的表达缺失与胃癌组织分化程度之间无明显关系。3、K-ras阳性表达率主要在胃癌组织中高，是胃癌发生的一个因素。4、K-ras的阳性表达与胃癌组织各分化程度之间比较无明显关系。5、RASSF1A甲基化主要发生在胃癌组织中。说明RASSF1表达失活与启动子区CpG岛的高甲基化有关。6、RASSF1A甲基化表达与胃癌组织各分化程度之间无明显关系。