背景近年来,在全球范围内肺癌的发病率、死亡率均出现持续上升,现肺癌已成为了最常见的恶性肿瘤之一。肺癌的发生机制尚不完全明确,大量研究资料表明,肺癌的发生与吸烟、职业因素、空气污染、电离辐射、遗传和基因改变等因素有关。肺癌的发生早期多与肺部良性疾病类似,无明显特殊的症状,患者就诊时大多处于晚期,失去了最佳的治疗时机。在肺癌的众多分类中,非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌类型的85%,它是肺癌最常见的一种类型。关于NSCLC的治疗,手术常常用于治疗早期,不能接受手术进行治疗的患者,多采取放疗、化疗、介入治疗、生物免疫等治疗方法,其5年生存率低。因此,进一步对NSCLC发病的分子机制进行深入的研究变得至关重要,寻找出对于肺癌治疗更多的新靶点,为治疗肺癌提供更多的机会和可能性。PCNP由日本科学家将其作为NIRF的一种底物于2004最先报道,PCNP是一种定位在细胞核内含有PEST的蛋白,查阅大量文献后发现,一些含有PEST序列的蛋白质大多主要参与细胞周期的调节和细胞的增殖过程。因此,我们猜测核蛋白PCNP在肿瘤的发展中起了作用。通过挖掘数据库后,我们发现核蛋白PCNP在宫颈癌、直肠癌和肺癌等一系列恶性的肿瘤中高表达。为了进一步弄清PCNP与肿瘤的关系,本课题组首先对PCNP与神经母细胞瘤的关系进行了探究,初步实验结果可发现,PCNP可抑制人神经母细胞瘤细胞的增殖,减弱细胞侵袭和迁移能力,抑制异体成瘤,增强了细胞凋亡能力,不过作用的具体机制还需要进一步研究。鉴于课题组的初步研究,我们决定进一步探讨核蛋白PCNP与肺腺癌之间的关系。实验进行前,课题组通过对上海芯超芯片公司提供的肺腺癌组织芯片统计分析后发现,核蛋白PCNP在肺腺癌组织中发生了高表达,而在癌旁组织中相反,出现了低表达。接下来,我们的研究小组选择了人非小细胞肺癌的A549细胞系进行了初步的一些预实验,包括MTS、EDU、平板克隆、细胞划痕、Transwell实验以及Western blot检测Bax蛋白表达情况,初步证实,PCNP可促进细胞的增殖、迁移。为了进一步验证PCNP对于肺腺癌的具体作用,我们选择人肺腺癌A549和H1299细胞作为研究对象,重新进行了之前的实验,为的是能够更进一步地研究核蛋白PCNP与肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的关系,此外,也希望能够为肺腺癌的预防、诊断、治疗、预后提供更多的可行的理论依据。目的探究PCNP与人肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及成瘤性之间的关系,并进一步探索可能的分子机制。方法查阅数据库;通过IHC在63个人肺腺癌标本和相应的癌旁组织(国家人类遗传资源共享服务平台,中国上海)中检测到PCNP的表达水平。然后收集4个接受手术的新鲜患者标本,以检测PCNP的蛋白质水平。为了明确PCNP在肺腺癌中的临床意义,我们进一步分析了PCNP水平与肺腺癌组织芯片中性别、年龄、病理分级等其他临床病理参数的关系。用G418和嘌呤霉素进行药敏实验后,将PCNP过表达和沉默质粒及其对应的对照质粒分别转染到人肺腺癌A549和H1299两种细胞系中。分别用G418和嘌呤霉素筛选它们以获得稳定表达的细胞株。Western blot免疫印迹和RT-PCR用于验证和确认每种稳定株的成功构建,采用TUNEL实验检测细胞的凋亡能力;采用EDU增殖实验、MTS测定实验、平板克隆形成实验来检测各肺癌细胞系稳定株细胞的增殖能力;采用细胞划痕愈合实验、Transwell迁移实验、Invasion侵袭实验以及软琼脂生长实验来检测各肺癌细胞系迁移、侵袭的能力;此外,用Western blot来检测各种凋亡蛋白、STAT3/STAT5信号通路表达情况,检测PI3K/AKT/mTOR信号通路、自噬相关蛋白P62/Becline-1/Lc3,分别探讨它们之间可能的关系;将各稳定株细胞注射到裸鼠腋下,检测PCNP对肺腺癌细胞裸鼠成瘤性的影响,并将小鼠肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果1、PCNP主要在细胞核内表达,PCNP水平在肺腺癌组织中高,但在相邻的非肿瘤组织中低,PCNP水平与肺腺癌的T分期有关。2、Western blot和RT-PCR检测肺腺癌细胞A549和H1299内PCNP表达量显示:过表达细胞组、沉默细胞组,及对照组稳定株均已构建成功。3、EDU实验、MTS实验和平板克隆实验检测A549和H1299两种细胞系增殖情况显示:PCNP增强人肺腺癌细胞的增殖能力和活力。4、细胞划痕实验、Transwell实验来检测细胞的迁移能力,采用Invasion侵袭实验、软琼脂生长实验来检测细胞的侵袭能力,结果显示:PCNP增强人肺腺癌细胞的迁移和侵袭的能力。5、TUNEL实验用来检测细胞的凋亡能力,结果显示:PCNP过表达的细胞组可抑制细胞的凋亡,沉默组相反,可促进凋亡。Western blot检测凋亡蛋白的表达量,结果与TUNEL结果相同,PCNP过表达组Cleaved Caspase3、Cleaved PARP表达水平降低,沉默组细胞表达量增多;过表达组p-STAT3、p-STAT5表达增高,沉默组降低。因此,从上述结果可以看出,PCNP抑制人肺腺癌细胞的凋亡,并可能通过STAT3信号通路介导肺腺癌细胞的凋亡。6、Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路及凋亡蛋白Beclin1、LC3、p62中蛋白表达量的变化,结果显示,与对照组相比,PCNP过表达组P-PI3K、P-AKT、P-mTOR表达量增加,沉默组表达量减少;PCNP过表达组Becline1和P62的蛋白质表达量增加,沉默组表达量减少,此外,LC3A/B的蛋白质水平呈现出相反的趋势。因此,PCNP过表达增加了自噬水平,PCNP敲低表现出相反的效果。总之,这些结果表明PCNP可能通过人肺腺癌细胞中的PI3K/Akt/mTOR途径增加细胞自噬。7、裸鼠皮下异种移植肿瘤模型实验表明PCNP促进人肺腺癌异种移植肿瘤的生长和血管生成。结论核蛋白PCNP增强人肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力,且可能通过STAT3/5和PI3K/Akt/mTOR信号通路调控细胞的凋亡和自噬过程,进而促进人肺腺癌的发生和发展。