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背景：急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是常见的临床危重症,是多器官功能衰竭的最常见形式。严重创伤、严重烧伤、失血性休克、败血症、急性胰腺炎和重症肺炎等疾病是造成ALl的常见原因。目前临床上ALl的病死率很高,而有效的治疗方法仍旧缺乏,因此深入研究ALI的必要性和紧迫性不言而喻。目前研究认为,ALI的本质是一种炎症反应,由多种炎症介质和细胞因子共同参与其发病过程。ALI的发生发展是一个复杂的过程,涉及许多信号转导通路,细胞外调节蛋白激酶(extraceeluar regulated protein kinases, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)等均参与了机体炎症反应的发生和发展,其中p38MAPK被认为是炎症反应中最重要的激酶,参与了炎症反应的发展与调控。脂多糖(LPS)可以激活p38MAPK激酶,促进内皮细胞激活,分泌细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的等炎症因子。丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶-2(MAPK-activated protein kinase-2, MK2)是1992年发现并纯化的第一个MAPK激活蛋白激酶,主要被p38蛋白磷酸化而激活,MK2在炎症方面的生物学功能日益重视,但它是否参与ALI以及其是否调节炎症通路的下游底物尚不十分清楚。人组织抗原R (HuR)是人胚胎致死视觉异常家族的成员之一,与多种炎症因子有着密切的关系。本实验室前期在体外研究中发现,MK2及HuR均参与了肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导肺微血管内皮细胞表达炎症因子IL-8及ICAM-1的调控。同时国外有作者应用转染MK2激活体等技术的研究显示：MK2可以促进HuR在细胞浆内聚集,并且HuR与mRNA的ARE的结合力增高,提高了目标mRNA的稳定性。但是,到目前为止MK2和HuR是否参与了ALI的发生与发展尚未在体内得到证实,我们通过建立动物ALI模型来观察MK2和HuR是否参与了ALI的炎症反应通路,并通过体外实验来探索MK2与HuR的相互关系及对炎症因子IL-6的调控作用。第一部分急性肺损伤时小鼠肺组织MK2和HuR表达的变化目的：采用小鼠ALI模型,观察肺脏MK2和HuR蛋白的表达变化,以及p-MK2和细胞核、细胞质中HuR表达的变化,探讨MK2和HuR在LPS致ALI时的作用。方法：采用腹腔注射LPS的方法复制ALI小鼠模型,将30只ICR小鼠随机分为2组：正常对照组(n=15)和LPS组(n=15)。LPS组腹腔内注射LPS (5mg/kg),对照组腹腔内注入等量的生理盐水(0.5ml),于注射后6小时处死,取肺组织。①观察肺组织病理HE染色、湿/干重比(wet/dry weight, W/D);②用免疫组化观察肺组织MK2和HuR的改变；③用Western bolt法检测总MK2和磷酸化MK2、HuR总蛋白和细胞质、细胞核中HuR表达量的变化。结果：①正常对照组小鼠肺组织结构正常,肺泡腔结构清晰,肺泡壁正常,肺间质无炎性浸润。LPS组肺组织中性粒细胞浸润、水肿和出血严重,可见肺泡结构破坏,伴局灶性肺气肿。LPS组湿/干重比较正常对照组明显增加(对照组3.42±0.05vs. LPS组4.46±0.11,P<0.05),符合ALI表现。②免疫组化显示：正常组织均有MK2和HuR蛋白的表达,LPS刺激后MK2蛋白量(平均IOD值：对照组4.1±0.27vs. LPS组3.92±0.54,P>0.05)及分布无明显变化,HuR两组总量也无明显变化(平均IOD值：对照组30.24±5.80vs. LPS组33.42±5.32,P>0.05),但LPS组细胞质中表达明显增加(平均染色面积：5.6×10-4±1.7×10-4vs.7.1×10-4±2.1×10-4, P<0.05)。③estern bolt方法检测显示：LPS刺激后肺组织中MK2表达总量无明显变化,而磷酸化MK2即p-MK2明显增加。HuR在正常组和肺损伤组小鼠肺组织中表达总量无明显变化,但在损伤组细胞质中表达量明显增加。结论：①结合HE染色和肺组织湿／干重比,腹腔注射LPS复制ALI模型成功。②正常肺组织即有HuR、MK2蛋白的表达,LPS刺激后MK2和HuR总量均无明显变化,但MK2磷酸化增加,HuR从细胞核转移到细胞质。③MK2磷酸化和HuR亚细胞定位改变可能参与急性肺损伤反应。第二部分MK2/HuR途径对TNF-a诱导的人肺微血管内皮细胞IL-6表达的调控目的：探讨MK2和HuR是否参与TNF-刺激人肺微血管内皮细胞时对IL-6表达的调控,以及可能的调控机制。为寻找新的治疗ALl的靶点提供实验依据。方法：①通过siRNA干扰方法沉默MK2,采用western blotting方法检测沉默效果,收集TNF-刺激后不同时间点的细胞上清液,应用ELISA方法检测IL-6表达量的变化；使用RT-PCR方法检测TNF-刺激后IL-6mRNA表达变化；用放线菌素D阻断mRNA的合成,检测不同时间点IL-6mRNA的含量并计算半衰期；观察MK2是否与IL-6mRNA稳定性有关。②通过siRNA干扰MK2表达,运用western bolt检测不同时间点TNF-刺激后细胞质中HuR含量的变化。③通过siRNA沉默HuR,应用Western blotting方法检测沉默效果,分别使用ELISA、RT-PCR方法检测TNF-α刺激后IL-6的蛋白、mRNA水平表达变化；使用放线菌素D阻断mRNA合成,计算沉默HuR前后IL-6mRNA半衰期的变化。结果：①使用siRNA干扰沉默MK2或HuR后,沉默效果均超过80%。②TNF-α刺激细胞后IL-6蛋白表达明显增加,与0h相比,12h和24h升高显著(p<0.05)。③MK2沉默对IL-6表达有明显的影响,与对照组相比,MK2沉默后IL-6的表达量在12h和24h明显降低,(IL-6表达量：12h时对照组4000pg/ml, MK2沉默组2000pg/ml,24h时对照组8000pg/ml, MK2沉默组5000pg/ml, p<0.05)。MK2沉默后IL-6mRNA表达与对照组相比明显减少。同时发现MK2沉默后半衰期明显缩短,IL-6mRNA的半衰期由原来的67min缩短为36min。④estern blotting结果显示TNF-α刺激增加了HuR蛋白在胞浆中的聚集,MK2沉默明显减少了细胞质中HuR的含量。⑤HuR沉默后IL-6上升水平明显低于对照组(IL-6表达量：12h对照组4000pg/ml, HuR沉默组3000pg/ml,24h对照组8000pg/ml, HuR沉默组6000pg/ml, P<0.05),且IL-6mRNA表达水平亦低于同时间点的对照组。使用放线菌素D阻断mRNA合成,发现HuR沉默后半衰期缩短,且缩短程度明显大于沉默MK2, HuR沉默后IL-6mRNA的半衰期从62min降低到24min。结论：LPS刺激后IL-6mRNA和蛋白水平表达均增加,MK2和HuR均能通过调控IL-6mRNA的半衰期调控IL-6的表达,MK2通过HuR来调控IL-6的表达,而MK2对HuR的调控可能是通过改变HuR在细胞中的亚细胞定位来实现的。