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目的建立体外分离、纯化和培养大鼠睾丸间质细胞的方法,探讨不同浓度、不同时间硫酸镍对大鼠睾丸间质细胞的毒作用及其机制。方法(1)采用胶原酶消化、Percoll分离液密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、纯化和培养大鼠睾丸间质细胞,并用3β-HSD染色法进行纯度鉴定。(2)取对数生长期睾丸间质细胞,硫酸镍(NiSO4)O、62.5、125、25O、500和1000μmol/L分别处理细胞3、6、12、24、36和48h；采用MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)法观察硫酸镍对睾丸间质细胞的毒作用。(3)取对数生长期睾丸间质细胞,硫酸镍(NiSO4)0、250、500和1000μmol/L分别处理细胞6、12和24h; Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测睾丸间质细胞的凋亡情况；实时荧光定量PCR和Western blot技术检测凋亡调控基因c-kit、caspase-3mRNA及蛋白的表达水平。结果(1)体外分离、纯化的睾丸间质细胞经3p-HSD特异性染色鉴定,纯度可达到95%以上。(2)相同时间NiSO4各浓度组与对照组比较：处理12h后,NiSO4各浓度组均出现细胞增殖抑制(P<0.01)；处理6h后,NiSO4各浓度组培养液中LDH活力均开始升高(P<0.05或P<0.01)。相同浓度各处理时间与对照组(0h)比较：NiSO4250μmol/L及其以上浓度组,各处理时间均可抑制间质细胞增殖(P<0.01)；除NiSO462.5μmol/L处理3h组外,其他各浓度不同处理时间LDH活力均明显升高(P<0.05或P<0.01)。(3) Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测结果显示：间质细胞凋亡主要发生于NiSO41000μmol/L处理12h和NiSO4250、500、1000μmol/L处理24h组。(4)实时荧光定量PCR结果显示：与对照组比较,NiSO4250μmol/L处理6h、NiSO4250和500μmo1/L处理12h后c-kit mRNA相对表达量上调(P<0.05); NiSO4500和1000μmol/L处理24h后c-kitmRNA相对表达量下降(P<0.05)。 NiSO4各浓度和各时间组caspase-3mRNA相对表达量均上调(P<0.05)。(5) Western blot结果显示：与对照组比较,NiSO41000μmol/L处理6h、NiSO4各浓度分别处理12h和24h, c-kil蛋白表达呈下调趋势,而NiSO4各浓度不同处理时间caspase-3蛋白表达均呈上调趋势。结论建立了较理想的体外分离、纯化和培养大鼠睾丸间质细胞的方法；硫酸镍对原代培养的睾丸间质细胞具有明显的毒作用,并呈现一定的剂量-效应和时间-效应关系；硫酸镍可诱导原代培养大鼠睾丸间质细胞凋亡,且与凋亡调控基因c-kit、caspase-3mRNA和蛋白异常表达有关。