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本文从以下几个部分展开论述： 第一部分 尾加压素Ⅱ受体参与三叉神经痛外周痛觉调节及机制 目的:建立小鼠眶下神经结扎三叉神经痛(TN)及三叉神经支配区CFA炎性模型,研究尾加压素Ⅱ对炎症痛及神经病理性疼痛机械痛觉的影响及相关蛋白激酶调节机制,为深入阐明尾加压素Ⅱ参与痛觉调控机制并拓展其临床应用积累学术基础. 方法:(1)应用小鼠眶下神经部分结扎(CCI-ION)模型,于结扎后1天、3天、7天、14天、28天分别检测机械痛阈.选取痛阈下降最显著的时间点,三叉神经节定位给药尾加压素Ⅱ(1nM)阻断剂,检测给药后30min,1h,2h及3h的机械痛阈值;(2)制备小鼠CFA面部炎性疼痛模型,不同时间点检测机械痛阈值(30min,1d,2d,3d,5d,7d,14d),并选取阈值最低时间点(2d)取材,应用蛋白电泳检测UT-R表达的变化;(3)制备小鼠CFA面部炎性疼痛模型,2d时间点检测机械痛阈值,三叉神经节定位注射给药尾加压素Ⅱ(1nM),分别检测给药后30min,1h,2h,3h及6h的机械痛阈值;(4)应用免疫荧光双标方法,检测三叉神经节神经元UT-R与NF-200、IB4及CGRP的共表达;(5)预先给药A-型钾通道阻断剂4-AP或T-型钙通道阻断剂Z941后,检测尾加压素Ⅱ给药后,小鼠机械痛阈值的改变;(6)预先给予PKA阻断剂或PKC阻断剂后,检测尾加压素Ⅱ给药后,小鼠机械痛阈值的改变. 结果:(1)CCI-ION能够显著降低小鼠的机械痛觉阈值,从结扎7天起,小鼠头部逃避阈值显著降低,一直可持续至28天;(2)三叉神经节注射UT-R受体拮抗剂palosuran能显著翻转CCI-ION诱导的机械痛觉阈值降低,且该作用在1小时内达到峰值,并持续至2小时;(3)面部三叉神经分布区域皮下注射CFA可显著诱导小鼠机械痛阈降低,在2天时最明显,可持续至第6天.CFA模型2天可显著升高三叉神经节UT-R蛋白表达;(4)皮下注射尾加压素Ⅱ可诱导面部机械痛觉阈值降低,且该作用可被UT-R受体拮抗剂所阻断,及被T-型钙通道阻断剂TTA-P2及Z941所模拟;(5)CFA模型2天后,皮下注射palosuran可翻转尾加压素Ⅱ诱导的痛阈降低,且作用可持续2小时;(6)三叉神经节内定位注射Cav3.2干扰siRNA可显著降低Cav3.2的表达,干扰Cav3.2可翻转CFA诱导的机械痛阈降低,应用UT-R受体拮抗剂并不能进一步增强Cav3.2的作用,提示Cav3.2可能是UT-R的分子靶标之一;(7)免疫荧光染色显示,UT-R与IB4及CGRP在小直径的三叉神经节神经元中共表达,而与NF200共定位较少.此外,UT-R与Cav3.2在中小直径TG神经元中也有共表达. 结论:尾加压素Ⅱ可显著降低三叉神经痛CCI-ION模型及外周炎性痛机械性痛阈,该作用通过UT-R及下游的PKA发挥作用. 第二部分 尾加压素Ⅱ受体调节三叉神经节神经元兴奋性及机制 目的:研究尾加压素Ⅱ对小鼠三叉神经节神经元兴奋性的调节作用,阐明其对动作电位频率、去极化幅度等指标的影响与机制,为揭示尾加压素Ⅱ受体参与三叉神经痛外周感觉调控提供直接的实验依据. 方法:急性分离小鼠三叉神经节神经元,应用全细胞膜片钳电压钳模式记录小直径神经元的动作电位.(1)电流钳模式记录小直径三叉神经节神经元的动作电位,细胞于分离后1-5小时内记录,统计100毫秒记录时程情况下,对照组及尾加压素Ⅱ给药组细胞的放电频率、半宽、静息膜电位、动作电位阈值等参数;(2)应用1毫秒记录时程,电流钳模式记录小直径三叉神经节神经元的动作电位,研究尾加压素Ⅱ对超级化后电位AHP的影响及机制;(3)应用UT-R拮抗剂及不同蛋白激酶抑制剂,研究尾加压素Ⅱ调节神经兴奋性的受体及信号转导途径;(4)应用T-型钙通道阻断剂NiCl2预孵浴三叉神经节神经元,在细胞外液中加入4-AP阻断A-型瞬时钾通道,研究尾加压素Ⅱ对神经元放电的影响;(5)应用A-型瞬时钾通道阻断剂4-AP预孵浴三叉神经节神经元,在细胞外液中加入Z941阻断T-型钙通道,研究尾加压素Ⅱ对神经元放电的影响. 结果:(1)给予细胞1秒刺激时程情况下,尾加压素II在0.1μM浓度时显著增加小直径三叉神经节神经元放电频率,而静息膜电位及动作电位峰值无明显改变;(2)给予细胞1毫秒刺激时程情况下,尾加压素Ⅱ在0.1μM浓度时显著升高小直径三叉神经节神经元动作电位后超级化电位AHP;(3)当细胞外液中加入T-型钙通道阻断剂NiCl2后,尾加压素Ⅱ诱导的神经元高兴奋性可被A-型瞬时钾通道阻断剂4-AP所阻断;(4)细胞孵浴PKC阻断剂GF109203X后,尾加压素Ⅱ诱导的神经元高兴奋性被显著抑制;(5)当细胞外液中加入A-型瞬时钾通道阻断剂4-AP后,尾加压素II诱导的神经元高兴奋性可被T-型钙通道阻断剂Z941所阻断;(6)细胞孵浴PKA阻断剂KT-5720后,在A-型钾通道被阻断的情况下,0.1μM尾加压素II诱导的小直径三叉神经节神经元高兴奋性被完全抑制. 结论:尾加压素Ⅱ通过UT-R受体及下游PKA及PKC途径参与三叉神经节神经元动作电位的调节,活化的蛋白激酶分别调节不同的离子通道进而改变放电频率. 第三部分 尾加压素Ⅱ受体调节A-型钾通道及T-型钙通道电流及机制 目的:研究尾加压素Ⅱ对小鼠三叉神经节神经元电压门控型离子通道的调节作用,阐明其参与神经元放电改变的分子机制,并为揭示尾加压素Ⅱ受体参与三叉神经痛调控及神经元高兴奋性提供离子通道基础. 方法:急性分离TG神经元,应用全细胞膜片钳电压钳模式记录小直径TG神经元,研究尾加压素Ⅱ对不同电压门控型离子通道的影响及信号通路机制.尾加压素Ⅱ给药浓度分别为1nM、10nM、0.1μM、1μM、10μM(细胞外给药),细胞破膜后3分钟给药记录不同电流:(1)应用不同的细胞内外液及相对应的刺激方波,记录不同电压门控离子通道(钠、钾、钙),研究尾加压素II对其影响及机制.(2)应用电生理学(双刺激方波)及药理学方法分离A-型钾通道电流,统计尾加压素Ⅱ加药前后的A-型钾通道电流密度大小,评价尾加压素Ⅱ对A-型钾通道电流的影响.(3)孵浴TG神经元不同的蛋白激酶阻断剂(HBDDE,U0126,PD98059等)及电极内应用不同的通路阻断剂(PKI5-24等),研究尾加压素Ⅱ对A-型钾通道电流的改变机制.(4)离体分离TG细胞,ELISA方法检测尾加压素Ⅱ对TG细胞的PKC活性的影响.(5)分离TG细胞,蛋白电泳检测MAPK家族激酶活性,研究尾加压素Ⅱ对p-ERK、p-p38和p-JNK水平的影响.预孵浴TG细胞蛋白激酶C阻断剂,研究尾加压素Ⅱ对ERK激酶活化的影响. 结果:(1)尾加压素Ⅱ显著降低小直径TG神经元A-型钾通道电流,且改作用具有剂量依赖性.同时0.1μM尾加压素Ⅱ左移失活曲线,对激活曲线无任何影响.(2)预孵浴TG神经元UT-R阻断剂palosuran完全阻断尾加压素II对A-型钾通道电流的抑制,并可逆转尾加压素Ⅱ对T型钙通道电流的增加.(3)电极内给药PKI5-24对尾加压素Ⅱ诱导的A-型钾电流降低无任何影响,但可完全阻断尾加压素II诱导的T-型钙通道电流增加.(4)电极内给药PKC抑制肽(PKC19-36)及钙螯合剂BAPTA均可显著抑制尾加压素Ⅱ诱导的A-型钾电流改变,而细胞外孵浴Go6976或电极内应用PKC19-36的结构类似物则无类似效应.(5)腺病毒包装的PKCalpha shRNA显著降低PKCalpha蛋白表达,且能抑制尾加压素Ⅱ诱导的A-型钾电流的降低. 结论:尾加压素Ⅱ通过激活UT-R受体,活化下游PKA及PKCalpha-ERK途径,分别调节T-型钙通道及A-型钾通道电流,进而参与三叉神经节神经元动作电位的调节. 综上所述,本文工作的主要创新之处在于: 1.发现尾加压素Ⅱ受体参与小鼠三叉神经痛外周感觉调节:本项目率先提出外周TG神经元UT-R参与三叉神经痛病理生理及外周痛觉调节.通过UT-R对三叉神经痛初级传入神经元功能调节及机制的研究,以眶下神经部分结扎及CFA炎症模型后UT-R表达增高及阻断UT-R后小鼠机械痛阈显著降低为切入点,提出并验证"UT-R通过调节TG神经元功能,进而参与三叉神经痛的外周痛觉调节"的假说,为三叉神经痛临床治疗学的突破提供有益的思路. 2.揭示尾加压素Ⅱ受体通过激活PKA及PKCα-ERK通路分别调控低电压T-型钙通道及A-型钾通道功能,参与神经元兴奋性调节:本课题涉及的分子神经生物学领域是当前三叉神经痛研究中的热点和前沿,本项目运用多种方法,包括行为学、免疫组织化学、分子生物学及电生理研究,从整体水平、组织学水平及细胞水平,阐明UT-R对TG神经元功能调节及相关分子机制.因而能够全面系统地研究UT-R在三叉神经痛中的外周调节机制,完善和发展三叉神经痛机制学说,为探索三叉神经痛的临床治疗途径和研发理想的治疗药物提供新的分子靶标.此外,本课题从三叉神经痛初级感觉传入神经元出发,探讨UT-R参与三叉神经痛的外周调节机制,并在功能学水平进行验证,具有原始创新性,在国内外尚未见报道.