荧光分子成像技术以无电离辐射、成像过程简单、成像时效性高、成本低等优势广泛的应用于生物活体成像的研究中。但是目前荧光成像存在一些问题:在激发荧光成像时,由于生物组织的自体荧光现象和激发光信号的残留造成较大背景噪声,严重影响信号的采集和定量分析。自发光成像虽然没有激发光带来的背景噪声的干扰,由于自发光信号比较微弱,会对生物成像质量造成一定的影响。本文选用具有较长荧光寿命和较强发光强度的长余辉材料,来解决传统荧光成像的不足之处,实现“免激发”生物发光成像。本文研究的主要内容如下:第一,设计搭建了用于长余辉成像的荧光成像系统,从系统设计、各模块选型、数据采集和图像预处理方面展开。该系统不仅可以完成长余辉成像实验,同时还可以开展透射激发荧光成像以及生物自发光成像实验。对系统的性能展开测试,通过分析成像系统总的噪声模型,探究成像过程中噪声的来源并制定相应的解决方案。根据系统的组成,设定了荧光成像系统数据采集分析的使用流程,并针对本荧光系统研究分析可以提高成像质量的优化方案。第二,对长余辉材料的粒径和水溶性进行相应的改善,使其能够满足生物成像的要求,并对其进行了相关光学性质的测试分析。通过和Cy5.5的对比实验,发现基于长余辉材料的荧光成像具有较高的成像分辨率和信噪比。基于长余辉荧光材料开展了动态荧光成像实验,结合药代动力学模型分析其代谢过程,结果表明长余辉动态荧光成像能够量化代谢过程。第三,结合扩散光学断层重建技术与长余辉荧光成像的特点,提出了单角度长余辉荧光断层成像方法。为解决重建问题的病态性,提出了一种稀疏约束的正则化正交匹配追踪算法,获得了良好的重建效果。单角度长余辉荧光断层成像,结合CT扫描的结构影像,可以获得长余辉纳米粒子在小鼠体内的三维分布。仿体和活体实验表明该方法优于传统荧光断层成像。