碳青霉烯类抗生素以亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)为代表，是一类高效广谱的β-内酰胺类抗生素。对于由产生超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBL)、AmpCβ-内酰胺酶(AmpCβ-lactamases，AmpC酶)的多重耐药革兰阴性杆菌引起的重症感染，碳青霉烯类抗生素是最后一道防线。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是医院内获得性感染重要的条件致病菌。随着碳青霉烯类抗生素在临床的广泛使用，PA对碳青霉烯类抗生素的耐药性正在逐渐增加，已成为抗感染治疗面临的严峻挑战。 目前研究显示，PA对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制主要包括药物通透性降低(外膜孔蛋白突变和外排泵机制)和产生碳青霉烯酶两大类。PA可以产生A型和B型(金属酶)碳青霉烯酶，其中，B型金属酶尤其受到关注。金属酶可以水解除氨曲南以外的所有β-内酰胺类抗生素，而且编码基因如blaIMP和blaVIM常位于I型整合子上。耐药基因的整合子定位使其可以通过各种方式在细菌间传递，极易造成广泛传播。PA产生质粒或整合子介导的B类金属酶国内外都有报道。 本研究调查亚胺培南耐药铜绿假单胞菌(imipenemresistantPseudomonasaeruginosa，IRPA)的耐药谱特征及相关耐药基因的携带情况以确定广州地区碳青霉烯酶流行的主要基因型。并在此基础上克隆主要碳青霉烯酶基因，表达，得到纯化碳青霉烯酶，旨在建立研究细菌β-内酰胺酶的技术平台，为进一步研究其生物学活性奠定基础。为此，我们收集了广州地区医院内感染铜绿假单胞菌进行了下列研究： 一、亚胺培南耐药铜绿假单胞菌耐药性及耐药相关基因的研究 收集2002年1月至2005年8月间广州地区4间医院临床分离的无重复铜绿假单胞菌500株，用纸片法筛选出70株IRPA并采用琼脂稀释法检测其对环丙沙星、阿米卡星等13种抗生素的最低抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)。为了解碳青霉烯酶携带情况，本研究用纸片协同试验检测金属酶表型并对碳青霉烯酶基因型别如IMP、VIM、OX23、OX24、SPM、GES及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合酶基因与编码外膜蛋白的OprD基因进行PCR扩增并测序。 结果显示，IRPA具有多重耐药性。所有的70株IRPA对所测试的多种抗生素高度耐药。敏感率由高到低依次为环丙沙星(27.1％)、妥布霉素(18.6％)、阿米卡星(14.3％)、庆大霉素(10％)和头孢吡肟(10％)。在70株IRPA中有7株菌(10％)纸片协同试验金属酶表型阳性。在金属酶表型阳性菌株中均检测到blaVIM-2型碳青霉烯酶基因并经测序证实。但所有70株IRPA均未能检测到其他碳青霉烯酶基因。40％菌株含有Ⅰ型整合酶基因，没有发现Ⅱ型和Ⅲ型整合酶基因。5.8％菌株能检出外膜蛋白OprD基因部分片段。 上述结果表明，VIM-2型碳青霉烯酶是广州地区铜绿假单胞菌碳青霉烯酶的主要流行基因型；以EDTA为酶抑制剂的纸片协同试验是一种简便、敏感的筛选产金属β-内酰胺酶细菌的检测方法。 二、铜绿假单胞菌VIM-2基因原核表达质粒的克隆与鉴定 将本地流行的主要基因型blaVIM-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，构建重组质粒pGEX-4T-1/VIM-2，转化克隆宿主菌JM109并用限制性酶切分析及测序鉴定。 测序结果经DNAMAN分析软件分析，显示插入片段阅读框架正确，无移码突变。目的基因序列提交BLAST分析，与GenBank中VIM-2型金属酶编码基因blaVIM-2基因(注册号：AF263520等)核苷酸序列的同源性为100％。重组质粒pGEX-4T-1/VIM-2构建成功。 三、VIM-2蛋白的表达、鉴定、纯化及生物学活性的初步研究重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)，诱导目的蛋白表达并优化表达条件。对重组蛋白进行Westernblot鉴定。通过包含体纯化方法及进一步的谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和层析法纯化目的蛋白。 结果显示，重组质粒在大肠埃希菌中表达了VIM-2与GST的融合蛋白，相对分子量约53KD，表达产物主要以包含体形式存在。其最优化条件为诱导时相OD550nm为0.5、诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5小时，目的蛋白占细菌总蛋白的41.7％。重组蛋白能够与抗GST的单抗特异性结合。目的蛋白经过纯化，纯度大于95％。 利用金属酶的特点初步检测了重组蛋白生物学活性。重组蛋白能水解底物头孢硝基噻吩和亚胺培南。生物学活性能被EDTA抑制，不能被他唑巴坦和邻氯西林所抑制，ZnCl2是激活剂，符合金属酶的特点。 上述结果表明，以融合蛋白的形式高效表达并成功地纯化了VIM-2融合蛋白。重组蛋白具有抗原性和生物学活性，为进一步研究酶活性、酶底物范围、酶动力学特点等工作奠定了物质基础。