论文部分内容阅读
目的:基于蛋白酶活性变化，阐述续断发汗后“蛋白酶活性-化学反应-药材性状”的相互关系，揭示中药材发汗加工影响续断质量的化学转化机制，推动续断发汗加工标准化研究，为其他中药材发汗的机制研究提供理论基础及研究思路。
方法:1.设计正交实验，考察续断样品的相对含水量、发汗温度及发汗时间对续断外观品质和质量的影响，优化续断发汗加工条件。2.基于优选的发汗条件，利用色差仪和电子鼻量化续断药材的色泽与气味，明确发汗与未发汗续断外观性状的差异。3.利用MCI柱色谱、大孔树脂、制备液相系统、NMR、HR-ESI-MS等多种波谱学分离与鉴定技术研究续断单体化合物，并利用HPLC法及HPLC-ESI-MS法建立同时测定其中多个单体化合物含量的方法。4.基于该方法和优选的发汗条件检测续断药材的化合物含量，明确发汗与未发汗续断内在质量的差异。5.利用iTRAQ技术构建发汗前后续断蛋白质组数据库，主要分析次生代谢物及抗氧化体系关键酶活性差异，并将续断发汗前后色泽及气味、化合物含量与蛋白酶活性两两相关性分析，揭示续断发汗加工的化学转化机制。
结果:1.优选续断发汗加工条件为将续断鲜品于60℃烘至相对含水量为(40±5)％时，25℃发汗5d，60℃烘干，即可。2.基于优化的续断发汗加工条件，检测发现发汗续断色泽a*值和b*值升高，L*值和△E*ab值降低，使药材颜色的红色、黄色和黑色加深，这3色叠加为墨绿色，即续断发汗后墨绿色加深;气味感应器LY2/LG、T30/1、P40/1、T70/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1、P10/1、P10/2、PA/2及TA/2的检测值为正值，且发汗后感应值升高，感应器LY2/gCT1、LY2/G、LY2/AA、LY2/gCT及LY2/Gh的检测值为负值，且发汗后感应值降低，表明13个正感应器检测化合物氧化气体、烃类、甲烷及芳香化合物等化合物的含量增加，使药材香气更加浓郁。3.从续断中分离得到13个化合物，其中化合物3-O-(2-O-乙酰基)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、5-羟甲基-2-呋喃甲醛、α-亚麻酸首次从续断属植物中分离得到。建立同时测定从续断中分离获得的川续断皂苷Ⅵ、续断苷A、续断苷B、当药苷、马钱甘酸、林生续断苷Ⅰ、马钱子苷和5-羟甲基-2-呋喃甲醛8个成分的方法。4.并用该方法和紫外分光光度法检测发汗与未发汗续断药材质量，表明发汗后川续断皂苷Ⅵ及5-羟甲基-2-呋喃甲醛含量升高，三萜总皂苷、续断苷A、续断苷B、当药苷、马钱甘酸、林生续断苷Ⅰ及马钱子苷含量降低。5.从续断发汗前后蛋白质组数据库中鉴定到26个萜类骨架生物合成关键酶，其中二磷酸甲羟戊脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶Ⅰ、异戊烷二磷酸胆甾醇等中上游关键酶表达量下调;鉴定到三萜皂苷及环烯醚萜苷类化合物生物合成关键酶各4个，环烯醚萜苷类化合物生物合成关键酶二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及2个新戊基脱氢酶关键酶表达量上调，而4个三萜皂苷类化合物生物合成关键酶表达量均下调。相关性分析显示续断发汗加工后，①续断苷A、续断苷B、当药苷、林生续断苷Ⅰ及总皂苷含量降低与关键酶磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸合酶、异戊烷二磷酸胆甾醇、二磷酸甲羟戊脱羧酶及乙酰辅酶A碳-乙酰转移酶表达量下调呈正相关;②马钱苷酸、马钱子苷含量降低与异戊烯半胱氨酸α-羧基甲基酯酶表达量上调正相关，推测马钱苷酸及马钱子苷在发汗过程中发生了自身降解，促使其含量降低;③三萜总皂苷的生物合成关键酶表达量多呈降低趋势，与磷酸甲羟戊酸激酶2上调表达正相关，而川续断皂苷Ⅵ含量升高，与(E)-4-羟基-3-甲基丁烯-2-烯醇-二磷酸合酶下调表达正相关，表明续断中其他多糖三萜皂苷可能发生糖与糖之间的断键或糖与糖苷键之问的降解，生成含糖基数较少、稳定性较高的川续断皂苷Ⅵ，弥补其降解部分，甚至多余降解量而使川续断皂苷Ⅵ含量增加。另外，从续断中鉴定到5539个蛋白质，有141个蛋白质差异表达，其中抗氧化生物酶占5.67％，且抗氧化生物酶表达量降低。进一步试验验证也显示续断发汗加工后，多酚氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性升高，脂质氧化物含量降低，组织抗氧化能力升高。相关性分析显示多酚氧化酶及过氧化物酶活性的升高，利于续断药材墨绿色的加深和芳香气味的变浓。
结论:续断发汗加工后，环烯醚萜苷的中、上游生物合成关键酶磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸合酶、异戊烷二磷酸胆甾醇、二磷酸甲羟戊脱羧酶及乙酰辅酶A碳-乙酰转移酶活性下调，抑制续断苷A、续断苷B、当药苷、林生续断苷Ⅰ的积累，而马钱苷酸和马钱子苷含量的降低很可能是其在发汗过程发生自身降解所致。发汗加工也下调三萜皂苷生物合成关键酶的表达，抑制三萜总皂苷含量降低;而川续断皂苷Ⅵ含量，推测是由多糖三萜皂苷发生糖与糖之间的断键或糖与糖苷键之间的降解，生成含糖基数较少、稳定性较高的川续断皂苷Ⅵ，弥补其降解部分，甚至多余降解量而使其含量增加。同时，续断发汗后多酚氧化酶、过氧化物酶活性增强，加速催化苯丙素类、环烯醚萜苷类等含有酚羟基的化合物发生氧化、开环、水解、聚合、延伸等生化转化而形成其他具有芳香气味的有色物质，进而改变药材的色泽和气味。
方法:1.设计正交实验，考察续断样品的相对含水量、发汗温度及发汗时间对续断外观品质和质量的影响，优化续断发汗加工条件。2.基于优选的发汗条件，利用色差仪和电子鼻量化续断药材的色泽与气味，明确发汗与未发汗续断外观性状的差异。3.利用MCI柱色谱、大孔树脂、制备液相系统、NMR、HR-ESI-MS等多种波谱学分离与鉴定技术研究续断单体化合物，并利用HPLC法及HPLC-ESI-MS法建立同时测定其中多个单体化合物含量的方法。4.基于该方法和优选的发汗条件检测续断药材的化合物含量，明确发汗与未发汗续断内在质量的差异。5.利用iTRAQ技术构建发汗前后续断蛋白质组数据库，主要分析次生代谢物及抗氧化体系关键酶活性差异，并将续断发汗前后色泽及气味、化合物含量与蛋白酶活性两两相关性分析，揭示续断发汗加工的化学转化机制。
结果:1.优选续断发汗加工条件为将续断鲜品于60℃烘至相对含水量为(40±5)％时，25℃发汗5d，60℃烘干，即可。2.基于优化的续断发汗加工条件，检测发现发汗续断色泽a*值和b*值升高，L*值和△E*ab值降低，使药材颜色的红色、黄色和黑色加深，这3色叠加为墨绿色，即续断发汗后墨绿色加深;气味感应器LY2/LG、T30/1、P40/1、T70/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1、P10/1、P10/2、PA/2及TA/2的检测值为正值，且发汗后感应值升高，感应器LY2/gCT1、LY2/G、LY2/AA、LY2/gCT及LY2/Gh的检测值为负值，且发汗后感应值降低，表明13个正感应器检测化合物氧化气体、烃类、甲烷及芳香化合物等化合物的含量增加，使药材香气更加浓郁。3.从续断中分离得到13个化合物，其中化合物3-O-(2-O-乙酰基)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、5-羟甲基-2-呋喃甲醛、α-亚麻酸首次从续断属植物中分离得到。建立同时测定从续断中分离获得的川续断皂苷Ⅵ、续断苷A、续断苷B、当药苷、马钱甘酸、林生续断苷Ⅰ、马钱子苷和5-羟甲基-2-呋喃甲醛8个成分的方法。4.并用该方法和紫外分光光度法检测发汗与未发汗续断药材质量，表明发汗后川续断皂苷Ⅵ及5-羟甲基-2-呋喃甲醛含量升高，三萜总皂苷、续断苷A、续断苷B、当药苷、马钱甘酸、林生续断苷Ⅰ及马钱子苷含量降低。5.从续断发汗前后蛋白质组数据库中鉴定到26个萜类骨架生物合成关键酶，其中二磷酸甲羟戊脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶Ⅰ、异戊烷二磷酸胆甾醇等中上游关键酶表达量下调;鉴定到三萜皂苷及环烯醚萜苷类化合物生物合成关键酶各4个，环烯醚萜苷类化合物生物合成关键酶二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及2个新戊基脱氢酶关键酶表达量上调，而4个三萜皂苷类化合物生物合成关键酶表达量均下调。相关性分析显示续断发汗加工后，①续断苷A、续断苷B、当药苷、林生续断苷Ⅰ及总皂苷含量降低与关键酶磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸合酶、异戊烷二磷酸胆甾醇、二磷酸甲羟戊脱羧酶及乙酰辅酶A碳-乙酰转移酶表达量下调呈正相关;②马钱苷酸、马钱子苷含量降低与异戊烯半胱氨酸α-羧基甲基酯酶表达量上调正相关，推测马钱苷酸及马钱子苷在发汗过程中发生了自身降解，促使其含量降低;③三萜总皂苷的生物合成关键酶表达量多呈降低趋势，与磷酸甲羟戊酸激酶2上调表达正相关，而川续断皂苷Ⅵ含量升高，与(E)-4-羟基-3-甲基丁烯-2-烯醇-二磷酸合酶下调表达正相关，表明续断中其他多糖三萜皂苷可能发生糖与糖之间的断键或糖与糖苷键之问的降解，生成含糖基数较少、稳定性较高的川续断皂苷Ⅵ，弥补其降解部分，甚至多余降解量而使川续断皂苷Ⅵ含量增加。另外，从续断中鉴定到5539个蛋白质，有141个蛋白质差异表达，其中抗氧化生物酶占5.67％，且抗氧化生物酶表达量降低。进一步试验验证也显示续断发汗加工后，多酚氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性升高，脂质氧化物含量降低，组织抗氧化能力升高。相关性分析显示多酚氧化酶及过氧化物酶活性的升高，利于续断药材墨绿色的加深和芳香气味的变浓。
结论:续断发汗加工后，环烯醚萜苷的中、上游生物合成关键酶磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸合酶、异戊烷二磷酸胆甾醇、二磷酸甲羟戊脱羧酶及乙酰辅酶A碳-乙酰转移酶活性下调，抑制续断苷A、续断苷B、当药苷、林生续断苷Ⅰ的积累，而马钱苷酸和马钱子苷含量的降低很可能是其在发汗过程发生自身降解所致。发汗加工也下调三萜皂苷生物合成关键酶的表达，抑制三萜总皂苷含量降低;而川续断皂苷Ⅵ含量，推测是由多糖三萜皂苷发生糖与糖之间的断键或糖与糖苷键之间的降解，生成含糖基数较少、稳定性较高的川续断皂苷Ⅵ，弥补其降解部分，甚至多余降解量而使其含量增加。同时，续断发汗后多酚氧化酶、过氧化物酶活性增强，加速催化苯丙素类、环烯醚萜苷类等含有酚羟基的化合物发生氧化、开环、水解、聚合、延伸等生化转化而形成其他具有芳香气味的有色物质，进而改变药材的色泽和气味。