论文部分内容阅读
涡虫属于扁形动物门(Platyhelminthes）涡虫纲(Turbellaria),在动物进化进程中出现了一系列发育上的关键性变化。涡虫具有强大的再生能力,对其再生机制等方面的研究一直是发育生物学研究的热点问题。Wnt信号途径是动物发育中关键的信号途径之一，对生物的生长发育有着至关重要的作用，Wnt信号途径调节影响着许多生命过程，包括细胞形态与功能的分化与维持、动物胚胎轴方向的形成、免疫、细胞癌变与细胞凋亡等。wnt基因对生物的发育有着至关重要的作用，近年来国内外对涡虫的wnt基因进行了不断的深入研究，研究技术越来越成熟。本文根据日本三角涡虫Djwnt1基因cDNA部分序列和地中海涡虫的Smed-wnt1基因的cDNA序列设计引物，采用RACE技术克隆得到日本三角涡虫Djwnt1基因的全长cDNA，并对其编码蛋白的氨基酸序列进行系统进化分析；采用原位杂交技术检测了Djwnt1在日本三角涡虫中的表达情况。已有报道显示，Djwnt1与涡虫尾部的再生有关，本文用庚醇处理涡虫，破坏细胞间隙连接，观察涡虫的再生情况，并通过原位杂交技术，检测涡虫体内Djwnt1的表达变化。Djwnt1 cDNA全长1632 bp，由72 bp的5’非编码区（5’-UTR），1263 bp的开放阅读框（ORF）和297 bp的3’非编码区（3’-UTR）组成，其中ORF区编码420个氨基酸的Djwnt1蛋白，在3’-UTR末端含有attaaa的加尾信号和24 bp的poly(A)序列。Djwnt1氨基酸序列是由25个氨基酸残基的信号肽，64个氨基酸残基的非功能区和331个氨基酸残基的功能肽组成的。Djwnt1含有24个保守的半胱氨酸残基，结构预测表明，这些半胱氨酸之间可以形成链内二硫键，从而形成短的发卡结构。序列比对表明日本三角涡虫Djwnt1与地中海涡虫Wnt1的氨基酸序列之间的相似性最高，为85.2%，而与哺乳动物、鱼类、爪蟾和其他无脊椎动物Wnt1之间的相似性相对较低；在进化树中，哺乳动物、两栖类动物和鱼类处于同一个分支上，说明哺乳动物、两栖类动物和鱼类的同源关系较近；涡虫与海葵和水螅处在同一个分支上，其中，涡虫与水螅进化关系最近，wnt1基因相似度为34.1%。原位杂交表明，在完整涡虫中，Djwnt1表达于中轴线靠后的细胞中。切断涡虫后，Djwnt1在损伤早期约12 h表达于损伤部位，在面向前端的损伤处和面向后端的损伤处都有表达。48 h后，面向前端的损伤处和面向后端的损伤处Djwnt1的表达有了变化，面向后端损伤处Djwnt1表达持续不变，且开始聚集于背中线的后极；而Djwnt1在48 h之后在面向极性前端损伤处的不再明显表达。用庚醇处理涡虫后，再生过程比对照组要延长一周左右。原位杂交表明，Djwnt1在损伤处的表达延迟约24 h。在36 h时有Djwnt1表达于损伤部位，72 h时在面向极性后端损伤处Djwnt1表达持续不变，且开始聚集于背中线的后极，而Djwnt1在面向极性前端损伤处表达量开始下降。96 h时Djwnt1在面向极性后端的损伤处聚集在背中线的后极表达，而面向极性前端的损伤处不再表达。