第一部分Artemin和GFRα3在偏头痛大鼠模型中表达的相关研究目的偏头痛是临床上常见的神经血管系统疾病,主要表现为反复发作、单侧搏动性头痛。至今为止,偏头痛的发病机制仍未完全阐明,其治疗也尚无特效的根治性方法。目前多数学者认为偏头痛的发病机理与三叉神经血管系统密切相关,该学说认为偏头痛的发病机制涉及三种机制:供应脑膜的血管扩张,血管周围神经释放血管活性肽引起神经源性炎症以及高位中枢下行抑制痛觉传导性降低,其中硬脑膜的神经源性炎症起关键作用,而引发这一过程的炎性细胞因子仍不完全清楚。近年来研究发现Artemin作为胶质细胞源性神经营养因子家族中的一员,通过与其特异性受体GFRα3结合发挥生物学作用,参与了炎性痛和痛觉致敏的病理过程。文献报道Artemin分布在硬脑膜区域的血管中,同时GFRα3表达在三叉神经节的感觉神经元中,但二者是否参与了偏头痛的病理发生过程目前尚未有系统研究。该实验旨在通过建立硝酸甘油偏头痛大鼠模型来探讨Artemin和GFRα3在偏头痛大鼠模型的表达变化及其具体机制,从而明确Artemin和GFRα3是如何参与偏头痛的发生过程,进一步完善偏头痛的发病机制,为偏头痛的治疗提供理论基础并寻求新的治疗靶点。方法实验分为三组:正常对照组、生理盐水对照组和硝酸甘油实验组,硝酸甘油实验组采用颈部皮下注射硝酸甘油建立偏头痛大鼠模型,生理盐水对照组颈部皮下注射等体积的生理盐水,正常对照组不做任何处理,然后观察大鼠行为学变化;对硬脑膜进行铺片并用免疫荧光技术检测Artemin在硬脑膜区域的表达情况;应用神经亲脂性荧光染料示踪及免疫荧光技术检测GFRα3在大鼠三叉神经节的定位表达情况;通过qRT-PCR技术检测Artemin和GFRα3mRNA水平分别在注射硝酸甘油/生理盐水不同时间点(2 h,4 h,6 h)大鼠硬脑膜和三叉神经节表达含量的变化;应用western blot技术检测Artemin和GFRα3的蛋白水平于硝酸甘油/生理盐水不同时间点(2 h,4 h,6 h,8 h,10 h)分别在偏头痛大鼠硬脑膜和三叉神经节表达含量的变化;用免疫荧光技术检测GFRα3蛋白在偏头痛大鼠三叉神经节表达部位和数量的变化。结果硝酸甘油实验组大鼠注射硝酸甘油后出现爬笼、原地打转、不断挠头、耳朵发红以及烦躁不安等行为学表现,生理盐水对照组大鼠注射生理盐水后除了偶尔有挠头现象外,无爬笼打转等烦躁行为学表现;免疫荧光结果显示,Artemin主要表达在硬脑膜的血管平滑肌细胞中,神经亲脂性染料示踪结果显示GFRα3和支配硬脑膜的三叉神经元共表达;qRT-PCR结果显示,硝酸甘油实验组大鼠硬脑膜部位Artemin mRNA水平在注射药物2 h和4 h时间点与正常对照组相比表达明显升高(p<0.05),硝酸甘油实验组大鼠三叉神经节部位GFRα3mRNA水平在注射药物4 h时间点与正常对照组相比表达明显升高(P<0.01),生理盐水对照组大鼠Artemin和GFRα3 mRNA水平各时间点的相对表达与正常对照组相比均无明显变化;Western blot结果显示,硝酸甘油实验组Artemin蛋白水平较正常对照组在注射药物4 h时间点表达升高并持续升高至8 h达高峰(p<0.05),硝酸甘油实验组GFRα3的蛋白水平较正常对照组在注射药物4 h时间点表达升高并持续升高至10 h(p＜0.05),生理盐水对照组大鼠Artemin和GFRμ3蛋白水平各时间点的相对表达与正常对照组相比均无明显变化;免疫荧光结果显示生理盐水对照组GFRμ3蛋白主要表达在三叉神经节少量且直径较小的神经元中,而硝酸甘油实验组GFRα3蛋白在三叉神经节表达的阳性神经元细胞数目显著多于生理盐水对照组,并且不仅表达在直径较小的神经元,较大直径的神经元也有大量表达。结论Artemin主要表达在大鼠硬脑膜区域血管平滑肌细胞中并且在偏头痛大鼠硬脑膜表达增加,同时,其受体GFRα3和支配硬脑膜的三叉神经元共表达并在偏头痛大鼠三叉神经节表达增加,说明Artemin可能参与了偏头痛发生时硬脑膜的炎症反应,并通过硬脑膜的外周神经纤维传入到三叉神经节激活GFRα3,从而参与调控偏头痛的三叉神经痛觉传导通路。第二部分Artemin在三叉神经节细胞对iNOS调控作用的机制研究目的近年来研究发现胶质细胞源性神经营养因子Artemin不仅对神经的发育、生长和再生起一定的保护作用,同时还参与了炎症和疼痛的病理发生过程。第一部分研究中发现Artemin和GFRα3分别在偏头痛大鼠硬脑膜和三叉神经节表达水平升高,但Artemin和GFRα3如何参与偏头痛三叉神经痛觉传导通路的具体机制仍需进一步研究。研究表明iNOS在偏头痛动物模型的硬脑膜区域表达增加,通过基因转录水平的调控产生大量的NO,从而调控偏头痛的病理发生过程。iNOS是一种非Ca2+依赖型酶,在正常组织中含量极低,主要被炎症和疼痛因子包括肿瘤坏死因子和干扰素等激活。但Artemin在三叉神经节细胞调节iNOS的具体机制并不清楚。因此,该研究旨在通过体外原代培养三叉神经节细胞,进一步探讨Artemin在三叉神经节细胞如何调控偏头痛相关病理因子iNOS的表达,从而明确Artemin及其受体GFRα3参与偏头痛三叉神经痛觉传导通路的具体机制。方法体外原代培养新生大鼠三叉神经节细胞和组织,培养48 h后进行免疫荧光染色,用神经元细胞标记物抗NeuN和抗TUJ-1抗体鉴定三叉神经节细胞;实验组原代培养三叉神经节细胞加入Artemin处理,于加药处理后15 min,30 min,1 h,2 h,4 h不同时间点提取细胞蛋白,正常对照组加入不含Artemin的等量培养基;应用western blot技术检测Artemin作用不同时间点iNOS蛋白水平的表达变化;应用免疫荧光技术检测iNOS、GFRα3和TUJ-1分别在三叉神经节细胞和组织的表达情况。结果免疫荧光染色结果显示,NeuN主要标记神经元的细胞核示神经元阳性细胞比例为91.8±2.7%,TUJ-1主要标记神经元的胞质和轴突示神经元阳性细胞比例为87.9±2.4%,说明该实验原代培养三叉神经节细胞纯度较高;western blot结果显示,iNOS蛋白含量在Artemin处理15 min后表达迅速增加并在随后的时间表达水平降低;免疫荧光结果显示,在原代培养的三叉神经节细胞和组织中,iNOS和GFRα3蛋白表达水平在Artemin实验组相对于正常对照组表达均升高,另外,Artemin诱导的iNOS表达分别和TUJ-1、GFRα3在三叉神经节细胞中共表达。结论在原代培养三叉神经节细胞中,Artemin可快速诱导iNOS的蛋白表达,提示这一过程可能参与了偏头痛早期的神经源性炎症和痛觉信号的传递。第三部分Artemin在三叉神经节细胞调控TRPV1/TRPV4的机制研究目的近年来,研究发现胶质细胞源性神经营养因子家族成员Artemin在神经源性痛和炎性痛发挥重要的调节作用,Artemin外周水平过表达可使初级传入神经元中瞬时感受器电位离子通道TRP(Transient receptorpotential)家族蛋白的表达升高并导致痛觉高敏现象发生。在偏头痛的发病过程中,初级传入三叉神经节细胞中伤害性受体TRP家族通道被激活,从而导致神经肽类物质释放。但Artemin如何调控TRP家族成员TRPV1和TRPV4的具体机制并不清楚,因此,该研究旨在通过体外原代培养三叉神经节细胞,进一步探讨Artemin在三叉神经节通过哪些信号通路调控伤害性受体TRPV1和TRPV4的表达情况,从而明确Artemin参与偏头痛三叉神经痛觉传导通路的具体机制。方法体外原代培养成年大鼠三叉神经节细胞,培养48 h后进行加药处理,实验组原代培养三叉神经节细胞加入Artemin处理,于处理后15 min,30 min,]h,2 h,4 h不同时间点提取细胞蛋白,正常对照组三叉神经节细胞加入不含Artemin的等量培养基;应用western blot实验技术分别检测Artemin处理后不同时间点p-p38,p-ERK1/2,TRPV1和TRPV4的蛋白水平表达变化;用免疫荧光技术分别检测Artemin作用后TRPV1、TRPV4和TUJ-1在三叉神经节细胞的表达变化。为了进一步明确Artemin是否通过ERK1/2和p38MAPK信号通路调控TRPV1和TRPV4的表达,对原代培养三叉神经节细胞分别进行ERK1/2和p38信号通路抑制剂U0126和SB202190预处理30 min,然后分别加入Artemin作用相应时间,用western blot方法检测TRPV1和TRPV4的蛋白表达含量变化。结果Western blot结果显示,和正常对照组相比,TRPV1的蛋白水平在Artemin作用2 h后蛋白水平表达升高并持续至4 h,而TRPV4的蛋白水平在Artemin作用1 h后表达升高并持续至2 h时间点达高峰;免疫荧光结果显示TRPV1和TRPV4蛋白表达水平在Artemin处理后均升高,另外,Artemin诱导的TRPV1/TRPV4表达和TUJ-1在三叉神经节细胞中共表达;Western blot结果显示,p-ERK1/2和p-p38蛋白的表达变化趋势不一致,p-ERK1/2蛋白表达在Artemin作用30 min时间点相对于正常对照组明显升高,接着在1 h时间点降低为正常水平,随后在2 h时间点较正常对照组表达再次升高,然而p-p38蛋白在Artemin处理后30 min表达升高并持续至2 h达高峰;另一方面,p38和ERK1/2信号通路抑制剂可降低Artemin诱导的TRPV1和TRPV4的蛋白表达。结论在原代培养三叉神经节细胞中,Artemin通过激活ERK1/2和p38 MAPK信号通路从而上调伤害性受体TRPV1和TRPV4的表达,这一过程可能参与了Artemin对偏头痛三叉神经痛觉传导通路的调控作用。