银杏(Ginkgo biloba L.)属于裸子植物门银杏科银杏属,且单属单种,系世界上现存最古老的树种之一,在裸子植物中属于原始类型。银杏特殊的进化地位奠定了其在植物分类、系统进化、形态解剖、生物学等方面的突出研究价值。历经了漫长的历史进化和人工栽植的干预,银杏发生了明显的变异,并根据银杏叶片或种子的变异特征将银杏划分为不同品种。叶籽银杏(Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.)作为银杏家族的特异种质,特点在于部分胚珠着生在叶片的边缘,且叶籽银杏具有稳定的可遗传变异,但目前对于叶籽银杏的发生机制尚不可知。开展叶籽银杏叶生胚珠的发生和发育过程中的分子机理和相关的遗传调控机制的研究具有重要的理论意义。MicroRNA(mi RNA)是一类长度为18~25个碱基的非编码内源小分子RNA,它通过作用靶基因mRNA来调控生物体内基因的表达,方式主要有直接裂解mRNA或抑制靶基因的翻译。且miRNA调控功能范围广泛,在植物器官分化、形态建成、极性发育、激素信号转导、胁迫响应、抗逆性等方面发挥重要的作用。开展叶籽银杏miRNA层面的研究,将有助于探明叶生胚珠发生过程中miRNA介导的基因表达调控模式,为叶籽银杏叶生胚珠发生的分子机制提供理论依据。本研究以叶籽银杏为研究材料,采用基于Solexa测序平台的新一代高通量测序技术分别构建发端期着生叶生胚珠叶片及正常叶片的sRNA文库,并结合生物信息学方法,鉴定miRNAs的种类及表达丰度情况,筛选出两样品间差异miRNAs;并以银杏转录组mRNA文库组装的unigene为参考序列,对差异miRNAs靶基因进行预测进而了解叶生胚珠发生的基因表达调控网络;采用实时荧光定量PCR技术定量分析叶籽银杏两样品间差异miRNAs及其靶基因的表达情况。本研究的主要结果如下:1.sRNA测序总体情况分析分别构建叶籽银杏着生叶生胚珠叶片和正常叶片sRNA文库,Solexa测序技术后分别获得22,401,208和19,042,060条原始冗余序列,通过去除接头、低质量等无意义序列后,得到21,876,638条和18,420,986条高质量的纯净序列(clean sequence),其中特异序列(unique sequence)分别为2,585,993条和2,640,731条。两文库中共有冗余序列占总数的88.49%,其中共有的特异序列占总共特异序列数量的15.91%。两个文库高通量测序长度分布统计表明,两文库中长度分布大体趋势相似,均在21nt和24nt有两个高峰。21nt冗余序列所占比例远远高于24nt,在着生叶生胚珠叶片和正常叶片文库中分别占到65.96%和56.77%。2.叶籽银杏保守mirnas将获得的高质量srna序列与来自genbank和rfam(9.1)数据库的非编码rna进行比对筛选,去除其他非编码rna,将候选的srna与mirbase20.0比对筛选完美匹配的保守mirnas。在两个样品中共鉴定来自23个家族的82个成员。除mir3522、mir1507、mir1509、mir1314外,绝大部分mirnas在其他物种中具有高度保守性。不同家族之间及同家族不同成员间的表达丰度变化较大。总体上,保守性越高,成员构成越多的家族表达量越高,如mir168、mir172、mir396、mir156、mir390。反之,保守性较低,家族成员数较少的家族表达量相对较低。对样品间保守mirnas进行差异分析,总计来自16个家族的25条保守mirnas在样品间存在显著性差异,其中16条mirnas在着生叶生胚珠叶片中上调表达。采用qrt-pcr验证了15个保守mirnas的差异表达情况,与高通量测序结果基本一致。3.叶籽银杏novelmirnas着生叶生胚珠叶片和正常叶片两个srna文库中,共预测53条novelmirnas,其中25个mirna*s也被检测到。34条novelmirnas在两个文库中均检测到,11条仅在着生叶生胚珠叶片中检测;8条仅在正常叶片特异检测。novelmirnas成熟序列长度范围在20-22nt,其中21nt为主要类型,所占比例达66.04%。同保守mirnas首位碱基偏好型一致,novelmirnas首位碱基也以5’端u为主要类型。novelmirnas前体序列长度为67-268bp,平均长度为126bp,平均前体序列的mfe为-46.0kcal/mol。novelmirnas表达丰度较保守mirnas低。novelmirnas差异分析表明,10条novelmirnas表达量在着生叶生胚珠叶片中显著上调;相反,11条表达量下调。不同novelmirnas之间表达水平差异较大,差异倍数在2到14之间。采用qrt-pcr技术验证了随机挑选的6个novelmirnas在两样品间的表达情况,与高通量测序结果基本一致。4.差异mirnas靶基因调控对保守及novelmirnas进行靶基因预测,靶基因多为功能未知蛋白或预测蛋白,还有部分为涉及生长发育和环境适应等方面的转录因子。对差异mirnas靶基因进行go注释,其中在着生叶生胚珠叶片中上调的38条mirnas对应靶基因111条unigene序列,而34条下调的miRNAs对应88条unigene序列。着生叶生胚珠叶片中较多的靶基因富集在生物调节(biological regulation)、发育过程(development process)、生殖(reproduction)和信号传递(signaling)催化活性(catalytic activity)等方面。叶籽银杏叶生胚珠发生过程中,差异mi RNAs可能通过参与植物激素调节及调控胚珠发育相关的基因的表达来发挥重要的调控作用。采用qRT-PCR对10个靶基因的差异表达进行检测,发现靶基因的表达模式基本与相应的miRNA差异表达情况相反。综上所述,通过对叶籽银杏着生叶生胚珠叶片和正常叶片构建sRNA文库,获得叶籽银杏保守及novel miNRAs,预测样品间差异表达的miRNAs对应的靶基因的功能,并采用荧光定量PCR技术验证部分miRNAs及其靶基因的表达。miRNAs及靶基因在叶生胚珠发生关键时期的差异表达,暗示了sRNA可能参与了叶生胚珠发生和发育过程中复杂的转录后调控。