研究背景与目的食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家之一。在中国食管癌的病理类型以鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)为主。阐释食管癌发生发展的分子机制,开发和改进食管癌的筛查和早期诊断技术,是降低食管癌发病率和死亡率的关键。本研究在miRNA芯片高通量筛选结合生物信息学分析的基础上遴选食管癌发生发展相关的候选miRNA,进一步扩大样本量,利用荧光定量RT-PCR技术验证并建立食管癌miRNA差异表达谱。在差异表达的miRNAs中选取反复验证的miR-183和miR-218进行后续的功能研究,探索miR-183和miR-218在食管癌细胞中的生物学作用,通过识别和验证其下游靶基因,初步探讨miR-183和miR-218影响食管癌细胞生长、增殖、凋亡等生物学行为的分子机制。同时针对miR-218在食管癌中的异常表达,进行初步的机制研究,为阐明食管癌的发病机理、发现候选生物标志提供线索。研究方法1.在针对食管癌相关环境危险因素的流行病学问卷调查的基础上,招募138例未接受放化疗的原发食管鳞状细胞癌患者,收集其癌组织及癌旁组织。送检3对食管鳞状细胞癌患者癌组织和配对癌旁组织,应用Agilent miRNA表达谱芯片技术筛选差异表达的miRNA.采用荧光定量RT-PCR技术在扩大样本人群中对筛选出的差异表达miRNA进行验证,构建食管癌miRNA差异表达谱。根据候选miRNA的表达水平,连锁分析miRNA的异常表达与食管癌发病风险之间的关系。根据环境危险因素调查结果,探讨候选miRNA表达水平与食管癌患者吸烟、饮酒、饮水之间的相关性。2.利用1niR-183 mimic 和 inhibitor分别转染食管癌细胞EC9706构建miR-183过表达及表达缺失的细胞模型,采用荧光定量RT-PCR方法检测转染后细胞miR-183的表达情况,确定转染效率。在此基础上分析miR-183对食管癌细胞生物学功能的影响,包括EdU法检测细胞生长增殖、Annexin-V FITC&PI双染法检测细胞凋亡、流式细胞术检测细胞周期分布、以及Transwell法检测细胞侵袭能力。利用靶基因预测软件和nRNA表达谱芯片共同预测miR-183靶基因,通过累积分布函数方法分析生物信息学预测得到的靶基因与非靶基因在芯片中表达水平的差异。荧光定量RT-PCR和Western blot方法验证miR-183在mRNA水平和蛋白水平对候选靶基因PDCD4的调控作用,并分析miR-183和PDCD4 mRNA在人群样本中表达水平的关联性。构建野生型和突变型PDCD43’UTR重组载体,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-183与PDCD4的靶向调控关系。进一步分别构建包含3’UTR和3’UTR缺失的表达载体pcDNA3.1-PDCD4,通过基因回复实验(DCD4 restore)分析miR-183通过影响PDCD4的生物学活性对食管癌细胞凋亡产生的调控作用,在功能层面验证miR-183和PDCD4的靶向调控关系。3.利用甲基化在线预测软件分析miR-218编码基因启动子区潜在的CpG位点。根据预测目的区域的DNA序列,分别采用亚硫酸盐测序(BSP)和巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)检测两株食管癌细胞EC9706和EC109中miR-218启动子区CpG岛甲基化状态。利用去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)分别处理食管癌细胞株EC9706和EC109,分析去甲基化处理后miR-218表达水平的恢复情况；进一步在癌组织和癌旁组织中用n-MS P分析miR-218表达水平与其甲基化状态之间的关系。荧光定量RT-PCR检测miR-218与宿主基因SLIT2、SLIT3表达水平的相关性,分析miR-218与宿主基因的共调控关系。利用miR-218 mimic转染食管癌细胞EC109构建miR-218过表达细胞模型,荧光定量PCR检测转染效率确定过表达模型构建成功的基础上,进一步分析miR-218对食管癌细胞生物学功能的影响。同时利用生物信息学方法预测miR-218靶基因,荧光定量RT-PCR和Western blot检测miR-218对靶基因ROBO1在mRNA水平和蛋白水平的调控,构建野生型和突变型ROBO1 3’UTR重组载体采用双荧光素酶报告基因实验进行靶基因鉴定。进一步分别构建包含3’UTR和3’UTR缺失的表达载体pcDNA3.1-ROBO1,通过基因回复实验(ROBO1 restore)分析miR-218通过影响ROBO1的生物学活性从而对细胞增殖能力的调控作用,在功能层面验证miR-218和ROBO1的靶向调控关系。4.招募食管癌患者和1：1匹配的健康对照血浆样本79对。应用实时荧光RT-PCR方法分别检测组织中差异表达的miR-183和miR-218在血浆中的表达水平。同时利用单因素logistic回归分析miR-183和miR-218在血浆中的表达水平与食管癌发病风险间的关系,通过ROC曲线分析评估血浆niR-183 和 miR-218在食管癌中的诊断价值。主要研究结果1.食管癌组织nicroRNA差异表达谱的筛选利用Agilent miRNA表达谱芯片筛选出15个食管癌组织中差异表达的miRNA,其中食管癌组织中表达上调的miRNA7个,下调的miRNA8个。利用荧光定量RT-PCR在扩大的人群组织样本中验证后,确认7个食管癌相关差异表达miRNA与芯片结果一致(miR-139-5p, miR-218, miR-338-3p, miR-21-3p, miR-574-5p, miR-183, miR-601),证实了芯片数据的可靠性。其中,miR-183在食管癌组织中高表达,miR-218在食管癌组织中低表达。通过单因素logistic回归分析发现其中niR-139-5p和miR-338-3 p的低表达,以及miR-21-3p、miR-574-5p、miR-183 和 miR-601的高表达与食管癌发病风险的增加显著相关,进一步利用多因素logistic回归分析发现miR-139-5p、miR-338-3p、 miR-574-5p和miR-601的异常表达增加了食管癌的发病风险,其中结合环境危险因素分析发现miR-21-3p的表达水平与饮酒量相关。2.miR-183调控食管癌发生发展的机制研究2.1 miR-183在食管癌细胞EC9706中功能研究分别应用]niR-183 mimic 和 inhibitor转染食管癌细胞EC9706 48h后,与对照组相比,mimic转染组miR-183的表达水平显著升高(p<0.001),inhibitor转染组miR-183的表达水平显著降低(p<0.001),明确转染成功后进行后续的细胞生物学功能实验。细胞凋亡结果显示,miR-183 mimic转染组早期凋亡率明显低于对照组(3.31±1.20 vs.7.43+1.01,p<0.001),晚期凋亡率亦显著低于对照组(5.83±0.29 vs.8.77±1.59,p<0.01)。而miR-183 inhibitor转染组早期凋亡率高于对照组(12.39±1.89 vs.6.56±1.87,p<0.001),晚期凋亡率也高于对照组(9.53士1.58 vs.7.36±2.42,p<0.05)。EdU法检测细胞增殖能力结果显示miR-183 mimic转染组中处于增殖期的细胞比例显著高于对照组p<0.05)。细胞周期结果显示转染miR-183 mimic细胞与对照组相比G1期比例显著下降(54.87±1.135vs.56.89±0.82,p<0.05)。2.2 miR-183在食管癌细胞EC9706中靶基因的识别与验证应用mRNA表达谱芯片在miR-183过表达EC9706细胞和对照组细胞中筛选候选靶基因。mRNA表达谱芯片共筛选出表达上调基因100个,下调基因83个,其中下调倍数前五位基因是：HLA-DRB5、ITGB1、MICB、PSEN2、PDCD4。对下调基因进行GO聚类和KEGG pathway分析。结果发现差异基因主要富集在细胞周期蛋白依赖性激酶调控信号通路上,并与多个肿瘤相关信号通路相关。基于芯片筛选结果,分别针对miRNA靶基因预测数据库TargetScan预测出的靶基因与非靶基因在芯片中的表达水平进行累积分布函数分析,结果发现TargetScan预测到的靶基因表达水平明显低于非靶基因(p<0.001)。结合miRNA靶基因预测数据库TargetScan和 miRDB,进一步分析并确认PDCD4为候选靶基因。荧光定量RT-PCR和Western blot结果发现miR-183主要抑制了PDCD4的蛋白质翻译过程。双荧光素酶报告基因结果显示,共转染miR-183 mimic和野生型PDCD4 3’UTR时,细胞荧光素酶活性被显著抑制,约为NC和突变型载体共转染组的47%(p<0.01),从而证实miR-183与PDCD4 3’UTR有直接靶向结合关系。通过相关性分析发现miR-183与PDCD4 mRNA的表达水平在食管癌组织中呈负相关关系(r=-0,189,p<0.05)。PDCD4 restore结果发现,分别转染包含3’UTR或3’UTR缺失的PDCD4表达载体时,细胞的凋亡率无显著性差异,而共转染包含3’UTR PDCD4载体和miR-183mimic时,细胞凋亡明显低于其他各组(p<0.01)。3. miR-218调控食管癌发生发展的机制研究3.1 miR-218 CpG岛甲基化状态检测应用CpG island searcher (http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx)分析miR-218编码基因(miR-218-K miR-218-2)启动子区CpG岛覆盖情况,结果发现编码基因miR-218-1转录起始位点TSS上游-760到一212处,编码基因]miR-218-2TSS的-407到+117处均为CpG岛富集区域。针对此区域DNA序列设计引物,采用BSP和n-MSP检测食管癌细胞株EC109和EC9706 CpG岛甲基化水平,发现miR-218-1和niR-218-2区域均呈现高甲基化水平。采用5-Aza-CdR去甲基化处理两株食管癌细胞EC109、EC9706和一株人正常食管上皮Het-1A,结果发现处理后细胞miR-218的表达水平升高,而Het-1A中miR-218表达无明显改变。利用n-MSP检测食管组织中miR-218-1和miR-218-2的甲基化水平,发现miR-218-1在癌组织中甲基化率(34/42)显著高于癌旁组织(14/42)p<0.05),但miR-218-2甲基化率在癌组织和癌旁组织中无显著差异。分别将组织样本按照miR-218-1 和 miR-218-2的甲基化水平将其分为甲基化组和非甲基化组,与miR-218的表达水平进行关联分析,结果显示miR-218-1甲基化组中miR-218的表达水平显著低于非甲基化组；而对于miR-218-2而言,其甲基化与否和miR-218的表达水平无显著相关性。荧光定量RT-PCR检测组织样本中miR-218、SLIT2、SLIT3的表达水平,结果显示,SLIT2在癌组织中表达水平为癌旁组织的38.5%(p<0.01),但SLIT3在癌组织和癌旁组织中的表达差异无统计学意义,而宿主基因SLIT2和SLIT3与miR-218的表达均显著相关(p<0.001),提示miR-218与宿主基因可能共转录。3.2 miR-218在食管癌细胞EC109中功能研究miR-218 mimic转染食管癌细胞EC109 48h后,与对照组相比,miR-218的相对表达水平显著升高(p<0.001)。EdU结果显示miR-218 mimic转染组中细胞增殖能力(53.45±1.20)%明显低于阴性对照组(73.61+3.21)%(p<0.001)。细胞周期结果显示miR-218mimic转染组的Gl期细胞比例增加(p<0.01),G2期减少(p<0.01),S期无明显变化。但]miR-218 mimic对细胞凋亡的改变并不明显。3.3 miR-218在食管癌细胞EC109中靶基因的识别与验证挑选靶基因预测数据库TargetScan、miRDB 和 Pictar 3个数据库均预测到的ROBO1为候选靶基因。荧光定量PCR和Western blot发现在mRNA和蛋白水平miR-218均能调控ROBO1的表达。双荧光素酶报告基因结果显示miR-218与野生型ROBO1 3’UTR共转染组荧光素酶活性与其他各组相比显著降低,是阴性对照与突变型ROBO1 3’UTR共转染组的55.7% (p<0.001)。相关性分析揭示了人群样本中miR-218与ROBO1 mRNA的表达负性相关(r=-0.258,p< 0.05)。ROBO1 restore结果表明,与对照组相比,包含3’UTR的ROBO1表达载体和1miR-218 mimic共转染时,细胞的增殖能力明显低于其他各组(p<0.01)。4.miR-183和miR-218在食管癌筛检中的诊断价值研究荧光定量RT-PCR结果显示,与健康对照比较,食管癌患者血浆中miR-183的表达水平明显增加(p<0.05),而miR-218的表达显著降低(p< 0.001). Logistic回归分析发现血浆中miR-218的低表达与食管癌发病风险的增加有关(OR=0.787,0=0.685-0.903)p<0.001)。ROC曲线评估血浆miR-218诊断食管癌的AUC为0.651(p=0.001)。初步研究结论1.本研究在食管癌组织和癌旁组织中共筛选分析得到7个差异表达的miRNA,其中3个miRNA表达上调,4个miRNA表达下调。miR-183在食管癌组织中显著高表达,miR-218在食管癌组织中显著低表达。2.增加食管癌细胞EC9706中miR-183的表达水平可诱导EC9706的增殖能力,抑制细胞凋亡,缩短G1期比例。miR-183通过作用于其靶基因PDCD4的3’UTR区域参与调控食管癌细胞的凋亡过程。3.miR-218在食管癌中的低表达与miR-218的编码基因miR-218-1启动子区CpG岛异常高甲基化有关。增加食管癌细胞EC109中miR-218的表达可有效抑制EC109的细胞增殖能力,阻滞细胞周期于G1期。miR-218通过作用于其靶基因ROBO1 3’UTR区域参与调控食管癌细胞的增殖。4.血浆中miR-218和miR-183的表达水平与组织中的趋势一致,其中miR-218在食管癌患者血浆中表达显著低于健康对照者,而miR-183在食管癌患者中表达显著高于健康者对照。根据血浆miR-218的表达水平,可以有效的区分食管癌患者和健康对照者,是食管癌潜在的诊断生物标志,可对现有食管癌早期诊断方法进行有效补充。