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文蛤（Meretrix petechialis）是我国一种重要的海洋经济贝类。然而,近年来在文蛤的养殖过程中频繁发生由细菌和病毒引起的病害问题。因此,通过分子手段研究在微生物侵染过程中文蛤体内的信号通路响应,解析文蛤天然免疫防御机制,可为培育文蛤的抗性品系提供良好的分子基础。小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor,MITF）是MYC转录家族成员之一,其通过本身的bHLH-LZ结构域直接调控下游靶基因的表达。MITF是控制细胞增殖、存活和免疫防御的信号转导途径的关键调节因子。在本研究中,我们鉴定了文蛤体内的MITF家族基因,分析了MITF在文蛤免疫防御和壳色形成中的重要作用,并对MITF的上下游通路进行探究,完善了MITF相关通路在贝类天然免疫防御中的调控机制。本研究的主要结果如下:1、本研究从文蛤中克隆获得了MITF基因的两个亚型,分别命名为MpMITF-1和MpMITF-2。其中MpMITF-1基因cDNA全长为3564 bp,包含1365bp的开放阅读框。通过组织表达分析显示,MpMITF-1基因在文蛤的各个组织中广泛表达。用50?l 5×106 CFU ml-1副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）注射文蛤后,MpMITF-1基因的表达量在6 h和12 h出现显著上调（P<0.05）。同时,在V.parahaemolyticus浸泡刺激后,MpMITF-1基因也出现表达上调的趋势,表明MpMITF-1参与文蛤应对弧菌的免疫响应。在MpMITF-1基因中通过SNP分型获得5个SNP和2个单体型与弧菌抗性性状相关。在文蛤抗性家系（Family-R）和敏感家系（Family-S）中对得到的分子标记进行验证,最终确定4个SNP（SNP2、5、6和13）和1个单体型（Hap1）与文蛤的弧菌抗性相关。同时,克隆获得MpMITF-2基因的cDNA全长为2026 bp,包含1116 bp的开放阅读框。MpMITF-2基因的组织表达分析显示,MpMITF-2在外套膜组织表达量很高,其他组织几乎不表达。同时,MpMITF-2基因在不同壳色品系的文蛤体内具有不同的表达量,证明MpMITF-2基因与文蛤的壳色形成相关。通过RNAi干扰MpMITF-2的表达后,新长出的贝壳壳色出现了不均匀的色素分布,充分说明MpMITF-2基因参与文蛤色素的合成。Phenoloxidase（MpPO）是MITF潜在的下游靶基因,也是参与色素形成的功能基因。当MpMITF-2基因的表达被干扰后,MpPO基因的表达量也出现显著下调。该研究阐释了MpMITF-2、MpPO和壳色之间的关系。2、本研究通过RNAi技术干扰了MpMITF-1的表达,发现其潜在的下游靶基因phenoloxidase（PO）、cathepsin K（CTSK）和BCL-2的表达量出现显著下调（P<0.05）,推测在文蛤体内MpPO、MpCTSK和MpBCL-2是受到MpMITF调控的下游靶基因。分别克隆获得了MpPO、MpCTSK和MpBCL-2基因的完整的开放阅读框,其中MpCTSK基因的ORF为1041 bp,编码346个氨基酸;MpBCL-2基因的ORF为705 bp,编码234个氨基酸;MpPO的ORF长度为2019bp,编码672个氨基酸。基因的组织表达分析显示,MpPO、MpCTSK和MpBCL-2基因在文蛤的6个组织内均广泛表达。在弧菌浸泡刺激文蛤后,MpPO、MpCTSK和MpBCL-2基因的表达量均出现显著上调,暗示它们参与文蛤应对弧菌的免疫响应。3、基于RNAi筛选得到的MpMITF-1的下游靶基因MpPO、MpCTSK和MpBCL-2,通过启动子扩增获得它们的启动子序列并检测到能够与MITF蛋白结合的E-box基序。通过EMSA实验发现,MpPO、MpCTSK和MpBCL-2的启动子序列与MpMITF-1蛋白直接结合;通过酵母单杂交实验进一步验证发现,MpMITF-1蛋白能调控下游基因MpPO、MpCTSK和MpBCL-2的表达。通过原核重组蛋白表达获得了MpPO和MpCTSK的重组蛋白,并利用最小抑菌浓度实验和抑菌圈实验发现MpPO和MpCTSK都可以抑制副溶血弧菌的生长,说明MpPO和MpCTSK通过抑制细菌的生长参与文蛤的免疫防御。同时,当BCL-2的活性被抑制后,文蛤血细胞的凋亡率显著上调（P<0.05）,推测MpBCL-2可以通过抑制血细胞的凋亡参与免疫防御。4、通过酵母双杂交技术对MpMITF-1的上游基因进行筛选,发现p38（MpP38）和p300（MpP300）能够直接与MpMITF-1蛋白发生直接相互作用。从文蛤中克隆获得MpP38基因的cDNA全长1720 bp,包含1095 bp的ORF,编码365个氨基酸;同时,获得MpP300基因的全长为2507 bp,包含1767 bp的ORF编码588个氨基酸。在V.parahaemolyticus浸泡刺激文蛤后,MpP38基因和MpP300基因的表达量都出现显著上调,说明它们响应弧菌的刺激。通过对MpP38和MpP300的调控机制进行研究,发现V.parahaemolyticus刺激可以促进MpP38的磷酸化,而MpP38的磷酸化水平会影响MITF下游靶基因MpPO的表达量的变化,表明磷酸化的MpP38通过激活MpMITF-1蛋白从而引起下游效应基因MpPO的表达。另外,通过酵母双杂交技术分别检测了MpP300的N端和C端与MpMITF-1蛋白的结合能力,结果发现MpP300的N端,而不是C端,能够与MpMITF-1直接结合。该研究揭示了MpMITF-1在发挥转录调控功能时自身受到的调控。