谷氨酸(Glutamate)作为神经系统内部分布最为广泛的一种兴奋性神经递质,广泛参与各种神经功能的调控。生物体通过复杂的神经传导通路实现对外周感觉信息的接收、传递和整合,从而对环境进行感知,进而产生合理的反应,以维系生物体的正常生理活动。大量的研究已经证实,谷氨酸作为经典的兴奋性神经递质,同样承载感觉信息的传递。躯体感觉信息传导系统主要包括脊髓传导路和三叉传导路,两者分别负责躯干感觉信息和口面部感觉信息向高级脑中枢的传递,已有的研究表明,这两条感觉传导路均由谷氨酸能神经元组成。其中,三叉传导路首先由位于三叉神经节(TG)及三叉神经中脑核(Vme)内的假单极神经元的外周突来感知口面部各种感觉信息的刺激,其中枢突将信息传递至三叉神经感觉复合体(TSNC,由尾侧向吻侧依次是三叉神经脊束核尾侧亚核Vc、极间亚核Vi、吻侧亚核Vo以及感觉主核Vp),再向上投射至感觉丘脑(主要包括丘脑腹后内侧核VPM和丘脑后核Po),经过整合最终传递至大脑感觉皮质。运用免疫组织化学及药理电生理的方法,研究人员已证实三叉传导路各级结构主要由谷氨酸能神经元组成,因此,谷氨酸在三叉系统各级神经元突触传递间的释放活动,对于口面部感觉信息的正常传递具有重要意义,也可能是介导三叉神经痛在内的各种口面部异常感觉疾病的潜在发病因素。　　经典的模型认为,神经递质主要是通过突触小泡释放入突触间隙的,而组成负责谷氨酸释放的突触小泡的膜蛋白,直到上世纪末才被成功克隆,他们也因此被命名为囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT)。到目前为止,先后有三种亚型的VGLUT被克隆,分别是VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3。其中VGLUT1和VGLUT2特异性地表达于谷氨酸能神经元内,因此目前被广泛应用为谷氨酸能神经元的标记蛋白。随着对这两种蛋白研究的不断深入,研究人员发现了一种极为有趣的现象,即VGLUT1和VGLUT2在神经系统内呈互补分布模式,前者主要表达于皮层和前脑,而后者则主要表达于丘脑和脑干,且在整个神经系统内,单个神经元内VGLUT1与VGLUT2的共表达也是极为少见的。这就引发了一个疑问,为什么同样的功能要招募不同的两个蛋白来完成,且二者在定位上互相排斥,最有可能的解释就是,虽然两型VGLUT同样都能介导谷氨酸的囊泡释放,但二者仍很可能存在某种功能学上的差异。　　事实上,已经有一些研究表明,VGLUT1与显示活动依赖性的突触可塑性(如LTP,long term potentiation)的突触结构密切相关,而表达VGLUT2的突触结构则具备信息传递的高保真度。另外,利用基因敲除动物的研究也发现,敲除VGLUT1的动物与敲除VGLUT2的动物的行为障碍表现是不同的。越来越多的形态学研究也不断证明,两种 VGLUT在神经系统内呈高度的互补分布。一系列的研究均表明, VGLUT1与VGLUT2,虽然在氨基酸构成上有高达82％的相似度,虽然同样构成介导谷氨酸突触释放的囊泡蛋白,但二者一定存在某种功能上的差异。　　前文已经提到,口面部感觉信息的传递是由三叉神经传导路上的各级谷氨酸能神经元实现的,那么,特异性表达于谷氨酸能神经元内的两种不同类型的囊泡膜谷氨酸转运体,即VGLUT1与VGLUT2在三叉系统内的表达是否同样符合互补分布的特点,如果是这样,二者是否存在功能学上的差异,从而使得整个三叉神经传导系统通过招募不同亚型的VGLUT来对不同类型的口面部感觉信息进行传递和整合。揭开这些疑问,将更有利于我们阐明兴奋性三叉神经传导系统的正常生理功能,还可能揭开某些口面部感觉障碍,尤其是口面部异常疼痛(如三叉神经痛)的可能发病机制。实验内容如下:　　第一部分口面部初级感觉信息传递通路内两型VGLUT的表达　　目的:分析三叉神经初期感觉纤维终末内 VGLUT的表达类型和来源,初步阐释口面部初级感觉信息传递过程中两种 VGLUT发挥的可能作用。方法:利用免疫荧光双重标记技术观察TSNC各亚核内VGLUT1与VGLUT2阳性终末的分布以及两种 VGLUT在单个终末内的共存;切断三叉神经感觉根后观察 TSNC各亚核内VGLUT1与VGLUT2免疫阳性终末密度的变化;利用跨三叉神经节束路追踪结合双重免疫荧光标记技术观察 TSNC内外周来源的初级感觉信息传递纤维内 VGLUT的表达类型。结果:除Vc浅层集中分布VGLUT2以外,TSNC各亚核内VGLUT1与VGLUT2阳性终末均匀分布,但不存在两种 VGLUT在单个终末内的共存;切断三叉神经感觉根后,同侧Vp、Vo、Vi以及Vc内VGLUT1阳性纤维密度显著下降,而VGLUT2阳性纤维密度则无明显变化,仅Vc浅层内VGLUT2阳性纤维密度下降;外周注射标记有髓纤维的跨节示踪剂CTB后,Vp、Vo、Vi以及Vc深层内分布有丰富的CTB阳性纤维终末,标记终末内表达VGLUT1而不表达VGLUT2;外周注射标记无髓纤维的跨节示踪剂WGA-HRP后,仅Vc浅层内分布有WGA-HRP阳性纤维终末,且阳性终末内表达VGLUT2而不表达VGLUT1。结论:口面部外周初级感觉信息传递纤维主要表达VGLUT1,这也是TSNC内VGLUT1阳性终末的主要来源, TSNC内VGLUT2阳性终末则主要来源于中枢,但Vc浅层内部分来源于外周的无髓神经纤维内也表达 VGLUT2,提示口面部外周初级感觉信息的一般信息和伤害性信息分别与VGLUT1和VGLUT2的功能相关。　　第二部分TSNC传出投射-口面部二级感觉信息传导通路-内两型VGLUT的表达　　目的:检测 TSNC各亚核向不同上位中继脑结构发出的传出投射的纤维终末内VGLUT的表达类型,初步阐释口面部二级感觉信息传导路中VGLUT1与VGLUT2的参与作用。方法:采用双重荧光原位分子杂交(dual FISH)方法检测VGLUT1 mRNA与VGLUT2 mRNA在TSNC各亚核内的表达与共存,采用顺行束路追踪结合多重免疫荧光标记以及双重免疫电镜检测 TSNC各亚核传出投射终末内 VGLUT的表达类型;采用逆行束路追踪结合 FISH检测 TSNC内丘脑及小脑投射神经元内 VGLUT mRNA的表达类型。结果:Vo、Vi以及Vc内VGLUT1 mRNA与VGLUT2 mRNA杂交信号鲜有共存,Vp内存在大量中小直径神经元同时表达 VGLUT1 mRNA与VGLUT2 mRNA;Vo、Vi以及Vc投射到丘脑的纤维终末仅表达VGLUT2,而向小脑投射的纤维终末仅表达VGLUT1,Vp向VPM投射的纤维终末同时表达VGLUT1与VGLUT2,逆行束路追踪结合FISH检测结果与此相符合。结论:TSNC内向感觉丘脑投射的神经元主要是VGLUT2 mRNA阳性的,而向小脑投射的神经元主要是VGLUT1 mRNA阳性的,Vp内向VPM投射的神经元同时表达VGLUT1 mRNA与VGLUT2 mRNA。　　第三部分下调延髓背角内VGLUT2对口面部痛信息传递的影响　　目的:观察靶向下调大鼠延髓背角内VGLUT2的表达对其痛行为的影响。方法:利用携带报告基因的VGLUT2表达质粒以及表达针对VGLUT2 shRNA的表达质粒共转染HEK293细胞,对预先设计的VGLUT2 shRNA片段进行体外筛选;包装能够表达所筛选VGLUT2 shRNA片段的慢病毒载体,感染大鼠原代培养神经元,验证对VGLUT2的表达下调作用;将该慢病毒载体注射入大鼠延髓背角,观察对大鼠口面部痛行为的影响。结果:利用luciferase荧光酶报告值在体外成功筛选出能够有效下调 VGLUT2表达的shRNA片段,表达该片段的慢病毒可以高效感染大鼠原代培养皮层神经元并有效下调其内VGLUT2的表达,将该慢病毒载体注射入大鼠延髓背角在有效下调其内VGLUT2的同时,还能削弱痛模型动物的痛敏行为。结论:靶向下调大鼠延髓背角内VGLUT2的表达可以有效干预动物的痛行为。