白血病是我国最常见的造血系统恶性肿瘤之一,发病率在恶性肿瘤中居前十位,是35岁以下青少年和儿童恶性肿瘤死亡的首位原因,而且发病率每年有递增趋势,成为严重威胁人类健康的恶性疾病之一。目前白血病的治疗已由传统单一肿瘤药物的治疗发展到造血干细胞移植、靶点药物等的治疗,多种治疗方式和手段的综合运用,使白血病得到很大程度的缓解,但药物作用产生的相关毒性、非选择性以及复发难治等问题促使人们研究各种新型的、更具靶向性的生物制剂应用于白血病的治疗,病毒的基因治疗就是其中新兴的方向之一。近年来,病毒的基因治疗在临床应用明显增多,病毒载体临床应用中,有25%是腺病毒,而其中75%用于肿瘤的临床治疗。溶瘤腺病毒又称条件复制型腺病毒(CRAd),以其能在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞的特性,成为抗肿瘤治疗的一个新策略。针对造血细胞的肿瘤,近些年来有报道将Ad5纤维顶球(fiber)基因替换为Ad35同源基因(Ad5/f35)的溶瘤腺病毒,它增强了对造血肿瘤细胞的感染性和抗肿瘤作用,但它们是基于腺病毒E1B55K蛋白表达缺失实现在肿瘤细胞中的特异性复制,而E1B55kD蛋白表达缺失,会影响腺病毒自身在肿瘤细胞中的复制从而削弱其抗肿瘤作用,因而针对造血细胞的肿瘤仍需开发更具靶向性和强大抗瘤效应的生物制剂。本研究将fiber替换(Ad5/f11p, Ad5的fiber替换为Adllp的同源基因)和启动子替换(端粒酶逆转录酶启动子TERTp,简称为TPE基因,替换内源性的E1A启动子)的靶向转录相结合,构建一株对造血肿瘤细胞敏感,并能在其中高效复制的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP,通过体外实验我们证实该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo、U937、Jurkat、K562的感染及杀伤作用,从而为进一步开发人白血病治疗的靶向腺病毒载体奠定基础。有关同时携带fl1p和TPE基因的嵌合腺病毒杀伤白血病细胞的研究,目前国内外均未见报道。另外,新近的研究表明腺病毒相关基因对人细小病毒B19的复制有辅助作用,这一辅助作用帮助B19V实现了在非容许细胞293中复制,并且产生了低水平的感染性子代病毒。但在B19V半容许细胞UT-7/Epo-S1中,这一辅助作用并不明显。造成这一结果的原因一方面考虑可能由于腺病毒对人造血肿瘤细胞UT-7/Epo感染效率低,影响腺病毒基因产物的表达,再者,UT-7/Epo细胞属悬浮细胞,质粒转染困难,两方面因素都会影响腺病毒基因对B19病毒复制的辅助作用的表现。因此我们尝试将构建的嵌合腺病毒(既能高效感染造血细胞又能在其中复制)作为人细小病毒B19体外培养的辅助病毒,观察B19在半容许细胞UT-7/Epo中的复制,为其作为细小病毒B19体外拯救和扩增的工具奠定基础。以改造的Ad5嵌合腺病毒为辅助病毒,体外扩增人细小病毒B19,目前国内外均未见有报道。本文研究内容包括以下两部分：第一部分：嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染第二部分：嵌合腺病毒对人细小病毒B19复制的辅助作用。第一部分：嵌合腺病毒对人白血病细胞的体外感染目的构建携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒Ad5f11pTPEGFP,其嵌合有Adllp的纤毛蛋白基因(简称f11p基因),并且E1A的启动子替换为端粒酶逆转录酶启动子(promoter of telomerase reverse transcriptase, TERTp,简称为TPE基因)。通过体外实验证实该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo、U937、Jurkat、K562的感染及杀伤作用,为进一步开发人白血病治疗的靶向腺病毒载体奠定基础。方法构建嵌合腺病毒质粒Ad5f11pTPEGFP,脂质体介导其转染至HEK293细胞包装出嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的嵌合腺病毒。以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的嵌合腺病毒感染人白血病细胞,通过荧光倒置显微镜、流式细胞术、透射电镜和病毒滴度分析病毒对细胞的感染性和复制活性；通过CCK-8(cell counting kit-8)法检测病毒对人白血病细胞株的生长抑制率反映该病毒对细胞的杀伤作用；通过AnnexinV-APC/7-AAD(别藻蓝素标记的膜联蛋白v和7-氨基放线菌素D)双染法检测嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP感染所诱导的早期细胞凋亡,并进一步采用Western Blot法检测嵌合腺病毒感染白血病细胞株后PARP(多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶,poly-(adenosinediphosphate ribose)polymerase)蛋白的裂解。结果(1)成功构建并制备了同时携带f11p和TPE基因的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP它能有效感染人白血病细胞,并呈时间依赖性和剂量依赖性；以相同剂量MOI=50感染人白血病细胞株,嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP产生的病毒滴度较空载体腺病毒Ad5GFP至少高2个数量级；(2)以空载体腺病毒Ad5GFP为对照,嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP对人白血病细胞株表现出明显的细胞毒性作用,呈时间依赖和剂量依赖；(3)以相同剂量MOI=50感染人白血病细胞株,嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP诱导细胞发生凋亡的细胞比例较空载体腺病毒Ad5GFP高,并且检测到随时间逐渐增加的裂解的PARP蛋白。结论成功构建并制备一株对人白血病细胞株敏感,且能在其中高效复制的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP; Ad5f11pTPEGFP能有效感染多种白血病细胞,并能显著抑制细胞生长,诱导细胞凋亡。本研究为进一步开发人白血病治疗的靶向腺病毒载体奠定了基础。第二部分嵌合腺病毒对人细小病毒B19复制的辅助作用目的克隆全长B19基因组,以构建的嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP为辅助病毒,在B19半容许细胞UT-7/Epo中由B19基因组拯救出有活性的B19病毒。方法先通过分子克隆技术分段获得B19ITR各片段,通过低温转化感受态细菌Sure2将ITR各片段依次连接,然后再与ITR以外B19基因组各片段连接获得全长的B19基因组,通过酶切和测序鉴定全长B19基因组克隆；以嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP为辅助病毒,使用电穿孔(Electroporation)方法将B19基因组转染至UT-7/Epo细胞。通过荧光定量PCR检测不同时间点(Oh、24h、8h、72h)B19基因组的拷贝数；从质粒载体上切下B19基因组克隆至腺病毒穿梭质粒,通过与Adeasy/f11p骨架质粒同源重组构建携带B19基因组的重组腺病毒质粒,将其转染293细胞,拯救重组腺病毒,以荧光定量PCR监测重组Ad5基因组和B19基因组的拷贝数。结果成功构建包含全长B19基因组的重组质粒pMD-B19N105,以嵌合腺病毒Ad5f11pTPEGFP为辅助病毒,转染pMD-B19N105至UT-7/Epo细胞,未观察到B19基因组拷贝数的显著增加；成功构建携带一半ITR的B19基因组腺病毒质粒pAd5fl1p-h1B19,转染293细胞,拯救的Ad5腺病毒基因组拷贝数未见明显增加,而B19基因组拷贝数减少。结论克隆了全长B19基因组。质粒转染的方式在UT-7/Epo细胞未能拯救出B19病毒；而以腺病毒质粒为载体的方式将B19基因组转染293细胞,观察到腺病毒的复制和增殖受到抑制,B19基因组丢失。本研究为进一步改进腺病毒载体,为其作为细小病毒B19体外拯救和扩增的工具奠定了基础。