论文部分内容阅读
目的：利用基因转染和RNA干扰技术将BCL11B(B cell lymphoma/leukemia 11B, BCL11B)重组质粒和小干扰RNA (siRNA)转染至正常人外周血初始T细胞(naiveT cells, CD3+CD45RA+T细胞)中,了解BCL11B基因在人类T细胞分化和增殖中的调节作用并初步探讨相关基因和信号通路变化情况。方法：(1)分别将真核表达质粒pIRES2-BCL11B-EGFP (pBCL11B)和化学合成的BCL11B-siRNA-935 (si-935)转染至细胞株,通过荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测转染效率,通过实时定量PCR和Western blot检测目的基因BCL11B在mRNA水平的表达和相应蛋白的合成情况。(2)采用核转染的方法将pBCL11B重组质粒和si-935有效转染至正常人naive T细胞。通过原子粒显微镜(AFM)分析BCL11B基因对naive T细胞微观形态学影响；利用PCR-基因扫描法分析T细胞受体(TCR)Vβ亚家族表达情况和克隆性变化；利用T细胞集落形成单位(CFU-T)分析BCL11B基因对T细胞体外增殖能力的影响；利用FCM检测BCL11B基因对T细胞免疫表型(CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD25和CD86)的影响。(3)利用Affymetrix U133 plus 2.0全基因表达谱芯片检测BCL11B基因表达模式改变后相关基因的变化情况,并选择部分差异表达基因进行验证。结果：(1) pBCL11B和siRNA-935转染不同细胞株的转染效率为20%～70%,在mRNA和蛋白水平能检测到BCL11B基因的稳定表达或有效抑制。(2) pBCL11B和siRNA-935转染naive T细胞后,同样分别表现为BCL11B基因的稳定上调或下调。BCL11B上调后的naive T细胞表现为胞体增大、膜表面颗粒物增多等活化和增殖的形态学改变,表达了17个TCR Vp亚家族,均呈多克隆性；CFU-T数量较多；CD4+／CD8+T细胞的比值增加了约一倍,有向Th亚群优势增殖的倾向。而BCL11B下调后的naive T细胞(si-935组)则未能检测到TCR Vp的表达,CFU-T数量减少,CD4+／CD8+T细胞比值变化不明显。(3)人类全基因组表达谱芯片显示,BCL11B上调后的naive T细胞,基因表达谱呈现了变化,包括有95个基因上调,124个基因下调；而BCL11B下调后的naive T细胞,则有302个基因表达上升,209个基因表达下降。差异表达的基因主要涉及与T细胞活化、增殖有关的CD3分子和IL-2的表达增高；与Th细胞分化有关的趋化因子CXCL10和CXCL11的表达增高和凋亡信号通路相关的抗凋亡基因CFLAR和凋亡因子CASP8、CASP10的改变,经实时定量PCR和ELISA验证这些基因的变化趋势符合芯片结果。结论：本研究在成功建立基因转染和RNA干扰有效上调或下调BCL11B基因的方法基础上,首次比较系统地分析了BCL11B基因对人T细胞分化和增殖的影响及其相关分子机制。BCL11B基因是T细胞生存所必须的,其表达的上升可促进T细胞的活化与增殖,促进T细胞向CD4+T细胞的分化；而BCL11B基因表达下降可抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。