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目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种致死性神经变性疾病,侵犯人体的运动系统,表现为肌肉萎缩和无力,并最终进展至呼吸肌,危及生命,一般发病后3-5年死亡。运动神经元的退行性变已被证明可由一些机制解释,包括氧化应激,谷氨酸兴奋毒性和凋亡等。这表明ALS是一种多因子起源的疾病。然而,选择性运动神经元丢失的确切机制依然不清,目前仍无特效治疗。ALS发病过程中,疾病早期即出现骨骼肌线粒体形态异常、功能障碍以及能量代谢异常等病理变化,线粒体功能异常可导致一系列相互作用的损伤过程,氧化应激、线粒体能量代谢障碍、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸释放过量,这些均能导致ALS的发生或恶化。这一发病机制正日益受到人们的关注。机体内活性氧(reactive oxygen species ,ROS)的产生和清除之间平衡障碍,导致ROS在体内的大量蓄积,产生氧化应激。氧化应激所致的线粒体损伤在运动神经元变性过程中起到了重要作用。解偶联蛋白(uncoupling proteins,UCPs)位于线粒体内膜上,是线粒体阴离子载体蛋白家族成员之一。目前UCPs已有五个成员,即UCP1-UCP5,其中UCP2,3的抗氧化功能已越来越引起人们的重视。在ALS的发病中,氧化应激参与了其中,因此我们推测, UCP3在ALS发病各阶段表达会有所改变。SOD1-G93A转基因小鼠是目前研究ALS较理想的动物模型,本研究通过观察SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌解偶联蛋白3表达水平及线粒体氧自由基水平的变化,深入研究解偶联蛋白3与氧化应激的关系,明确UCP3对于线粒体功能是否具有保护作用,以抗氧化应激和参与代谢紊乱为切入点,探讨其在肌萎缩侧索硬化疾病发生和进展中的作用。方法:选用小鼠共36只,均为雌性。实验分为2组:实验组为国际公认的SOD1-G93A转基因小鼠(SOD1-G93A+转基因小鼠),18只;同窝对照组,18只。各组根据病程分为30天,60天,75天,90天,症状期(onset,100-120天),终末期(ending,130-150天),每组3只。以10%水合氯醛( 350mg/Kg体重)腹腔注射麻醉后,新鲜取骨骼肌迅速投入液氮速冻后保存于-80℃冰箱。利用Western blot方法,检测各个发病阶段小鼠骨骼肌解偶联蛋白-3蛋白表达变化。应用RT-PCR检测各个发病阶段小鼠骨骼肌解偶联蛋白-3mRNA的表达水平变化。留取肌肉组织,进行脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CTA)及超氧化物歧化酶1(SOD1)的测定。并利用spss13.0对数据进行分析。结果:1 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌UCP3蛋白的动态表达1.1随疾病进展,SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌UCP3蛋白表达呈现升高的趋势,其中30d、60d、75d、90d四组之间无明显上升,差异无统计学意义;症状期较90d组明显升高(P<0.05);终末期较90d组明显升高(P<0.05);症状期与终末期相比较无统计学意义。1.2 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌UCP3蛋白表达与同窝对照组相比,症状期升高,差异有统计学意义(P<0.05),终末期明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。1.3同窝对照组UCP3蛋白表达水平随年龄增加无变化。2 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌UCP3 mRNA的动态表达2.1随疾病进展,SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌UCP3 mRNA表达呈现升高的趋势,其中60d较30d UCP3 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);90d较60d UCP3 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);终末期较90d组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);症状期与终末期相比较无统计学意义。2.2 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌UCP3 mRNA表达与同窝对照组相比,90天、症状期升高,差异有统计学意义(P<0.05),终末期明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。2.3同窝对照组mRNA表达水平随年龄增加无变化。3 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌MDA含量测定3.1随疾病进展,SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌匀浆MDA含量呈现升高的趋势,其中30d、60d、75d、90d四组之间无明显变化,差异无统计学意义;症状期较90d组明显升高(P<0.01);终末期较90d组明显升高(P<0.05);症状期与终末期相比较无统计学意义。3.2 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌匀浆MDA含量与同窝对照组相比,症状期明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),终末期升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.3同窝对照组MDA表达水平随年龄增加无变化。4 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌CAT含量测定4.1随疾病进展,SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌CAT含量呈现先降低后升高的趋势,90d为最低,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.2 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌CAT含量与同窝对照组相比,90d明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.3同窝对照组CAT表达水平随年龄增加无变化。5 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌SOD含量测定5.1随疾病进展,SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌匀浆总SOD含量及分型SOD(Cu-Zn SOD)含量无明显变化,不具有统计学差异。5.2 SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌匀浆总SOD含量及分型SOD(Cu-Zn SOD)含量与同窝对照组相比,无明显差别,不具有统计学差异。5.3同窝对照组总SOD含量及分型SOD(Cu-Zn SOD)含量无明显变化,不具有统计学差异。结论:通过对SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌UCP3表达水平及氧自由基的测定,本实验结果表明随着疾病进展SOD1-G93A转基因小鼠骨骼肌ROS产生增加,并且较同窝对照组明显升高,与之相应的UCP3 mRNA及蛋白表达水平升高,并且症状前期UCP3 mRNA就出现升高趋势。本研究证实了UCP3能够通过抗氧化应激和参与机体代谢紊乱在ALS疾病发生和进展中发挥作用,从肌肉水平为临床实践提供价值较高的早期诊断和病情监测标记物,并为ALS提供一个可能的治疗靶点。