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玉米大斑病(Northern Leaf Blight Corn)是全世界玉米产区的主要叶部病害之一,是由大斑凸脐蠕孢菌[Exserohilum turcicum(Pass.)Leonard&Suggs](无性态)侵染引起的,该病害在我国东北、华北北部、西北和南方山区冷量玉米产区发病较为严重。玉米大斑病流行可使玉米减产20～30%,给玉米生产带来严重威胁。目前关于玉米大斑病菌[SeSosphaeria turcia(Luttrell)Leonard&Suggs](有性态)致病因子的研究主要集中在细胞信号传导途径类、细胞壁降解酶类、氧化还原酶类、黑色素类以及毒素等方面。研究较为深入的一类为细胞信号传导途径包括:cAMP途径、MAPK途径、Ca2+途径等,但对AMPK途径的相关研究较少。SNF1蛋白激酶是AMPK在植物病原真菌中的同源蛋白,所以本文以SNF1基因为切入点,克隆玉米大斑病菌中StSNF1基因,利用生物信息学技术分析该基因编码蛋白的理化性质及结构特征,并利用实时荧光定量PCR技术监测玉米大斑病菌侵染寄主各个时期、分生孢子萌发侵染过程中以及不同碳源培养下StSNF1基因的表达情况,构建SrSNF1基因敲除载体并成功获得1个StSNF1基因突变体,研究结果总结如下:1.通过使用NCBI、JGI数据库的BLAST功能,明确SNF1基因在玉米大斑病菌基因组中的位置;利用玉米大斑病菌基因组数据库信息设计特异性引物SNF1F1和SNF1 R1,扩增出玉米大斑病菌SNF1基因;同源性分析表明,该基因在玉米大斑病菌中为单拷贝,将其命名为StSNF1;序列分析表明,该基因全长为3046 bp,由2个内含子与3个外显子组成,开放阅读框为 2634bp,编码 877个氨基酸,与玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)CcSNF1基因的结构高度相似。2.通过生物信息学分析技术对StSNF1基因编码的StSNF1蛋白进行分析。结果表明,该蛋白由877个氨基酸组成,分子量为97.94 kD,pI值为8.29,不稳定系数为53.24,总平均疏水性指数(GRAVY)为-0.638,为亲水性蛋白;在编码该蛋白的氨基酸序列中未检测到跨膜结构域以及信号肽的存在,推测StSNF1不属于膜蛋白或分泌蛋白;亚细胞定位结果表明,该蛋白在细胞核内的K-NN百分率为78.3%,推测该蛋白行使功能的主要场所为细胞核;在功能域方面,StSNF1包括1个N端域和1个C端域,N端域含有1个蛋白激酶结构域以及1个碳代谢产物去阻遏蛋白激酶泛素相关结构域(SNF1_UBA),C端则为5个激酶相关结构域1(KA1)的串联组合;二级结构分析表明,无规则卷曲的含量最多,其次为α-螺旋;同源性分析表明,该蛋白与玉米圆斑病菌的CcSNF1蛋白有较高同源性,一致性为90.92%,与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及其他病原真菌的同源性较低。3.通过实时荧光PCR技术研究玉米大斑病菌StSNF1基因的表达情况。结果表明,该基因在接种玉米后72h表达量达到最大,96h表达下调,120h又呈现上调趋势;在分生孢子萌发侵染过程中StSNF1的表达量逐步上调,24 h时(侵入丝形成时期)达到最大,为6 h时(附着胞形成初期)表达量的4倍,由此可以推测StSNF1与分生孢子萌发侵染有关;StSNF1基因在蔗糖培养基中的表达量最高,果胶培养基次之,在甘油培养基中的表达量最低,在葡萄糖和果糖培养基中的表达量趋于一致,分别是蔗糖与果胶培养基中表达量的1/3和1/2,由此可以确定StSNF1基因与蔗糖和果胶的利用有关。综上所述,StSNF1基因在侵染后期大量表达,在分生孢子萌发侵染过程中表达呈上调趋势,同时与碳源利用密切相关。4.通过对玉米大斑病菌遗传转化体系的优化,成功获得1个StSNF1基因突变体。研究发现,使用溶壁酶、崩溃酶、蜗牛酶混合酶解玉米大斑病菌孢子释放原生质体的最适温度为28℃,最适酶解时长为6～8小时,在此条件下原生质体的释放量最大。