干细胞相关研究是生物学领域的重大课题,其多能性调控机制也是人们研究的重点。在小鼠和人类中,PRDM14被认为是干细胞多能性网络的核心调控因子,参与多能性的维持、体细胞潜在全能性的重新获得、原始生殖细胞特化以及表观遗传重编程等重要过程,但是在其他物种中Prdm14基因是否具有类似功能尚不得而知。青鳉(Oryzias latipes)作为模式鱼类常被广泛应用于各种研究中,本实验以青鳉为材料,克隆并分析青鳉Prdm14基因的结构及进化关系,原核表达Prdm14蛋白并制备兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体,同时通过RT-PCR、Western blot、原位杂交等实验分析其在成体组织和胚胎发育过程中的表达模式,并在青鳉精原干细胞SG3中过表达以及在早期胚胎中敲除Prdm14基因来探究其在青鳉干细胞及胚胎发育中的作用,为鱼类干细胞分子调控机制的相关研究奠定基础。主要结果如下:1、扩增得到青鳉Prdm14基因的CDS,共1761 bp,包含8个外显子,编码586个氨基酸残基。比对分析常见研究物种的Prdm14氨基酸序列,发现青鳉Prdm14具有保守的PR/SET结构域及zinc finger结构。进化树分析显示青鳉Prdm14与其他物种的Prdm14同源基因聚为一支,同时归于硬骨鱼类的分支,说明Prdm14在进化上是保守的。2、构建原核表达载体pET32a-Prdm14?600,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),再经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。纯化蛋白并免疫家兔(Oryctolagus cuniculus),制备兔抗青鳉源Prdm14多克隆抗体,经ELISA和Western blot检测抗体效价及特异性。结果显示,该抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14:EGFP融合蛋白,能够用于后期Prdm14蛋白的检测。3、通过RT-PCR和Western blot分析Prdm14基因在青鳉成体组织中的表达,发现其mRNA及蛋白质在各个组织中均有分布,其中精巢、卵巢和脑组织中的含量较高。对精巢、卵巢切片和整个卵巢组织进行原位杂交分析,发现Prdm14的表达贯穿于精子和卵子发生的整个过程,预示青鳉Prdm14可能参与调控生殖细胞的形成。4、通过RT-PCR、qRT-PCR和整胚原位杂交实验分析了青鳉Prdm14在各个发育时期胚胎中的表达,结果显示其从囊胚期开始表达,原肠胚期表达量达到最高,并在随后的发育过程中表达量逐渐降低。5、将Prdm14:EGFP融合表达载体转入HepG2细胞,发现青鳉Prdm14定位于细胞核中,符合转录因子的特性。在SG3中过表达Prdm14并通过qRT-PCR检测干细胞相关转录因子的表达水平,发现Nanog、Oct4、Sox2、Lin28的RNA表达量均上升,同时过表达组SG3细胞生长速度比对照组明显加快,表明青鳉Prdm14可能参与干细胞多能性调控网络。6、利用CRISPR/Cas9技术在青鳉早期胚胎中敲除Prdm14,观察到原肠胚期之后的胚胎死亡率明显上升,并且出现畸形胚胎,检测畸形胚胎的基因组DNA发现在靶位点处均发生了突变;当将Prdm14 m RNA与gRNA、Cas9 mRNA共同注射时,胚胎死亡率和畸形率均降低,表明其m RNA具有一定的挽救效果。以上结果表明Prdm14在青鳉胚胎发育过程中具有重要作用,其缺失可能会导致胚胎的畸形或者死亡。