研究背景乳腺癌是女性人群发病率最高的肿瘤。近年来在全球范围内,其发病率呈逐年上升的趋势。2015年,CA期刊在线发布了《2012年全球癌症统计》显示,全球每年有约120万女性患乳腺癌,约有50万患者死亡,发病率占全年各种恶性肿瘤的7%-10%。根据《2015年中国肿瘤登记年报》,我国的女性乳腺癌发病率已达到35-45人/10万人,其发病率也呈逐年上升的趋势,已经是我国女性发病率最高的肿瘤。并且,我国妇女乳腺癌发病平均发病年龄较西方国家提早了10年,有向年轻化发展的趋势。可见,我国乳腺癌防治面临严峻的形式。尽管随着疾病筛查和诊疗水平的进步,乳腺癌的早期诊断和治疗有长足的进步,病人的生存率和生活质量有明显的提高。但是还有相当一部分病人因乳腺癌而死亡,其中最主要的因素就是乳腺癌发生了转移(约占乳腺癌病人的20%)。目前的治疗手段很难抑制这一过程,对发生转移的病人治疗效果也不尽人意。因此,进一步阐明乳腺癌转移的机制,寻找治疗的新方法是乳腺癌防治的焦点。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是调节体液平衡和血压的重要系统。既往的研究主要关注于血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme, ACE)/血管紧张素Ⅱ (AngiotensinⅡ, AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ 1型受体(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)轴的作用。近年来,RAS系的新组分血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme2, ACE2)血管紧张素(1-7)(Angiotensin-(1-7), Ang-(1-7))/Mas受体轴的作用日愈受到关注。ACE2是2000年发现的一种类似ACE的酶,ACE是一种肽酞二肽酶,有两个酶催化区；而ACE2是羧肽酶,只有一个酶催化区。ACE的作用是水解AngⅠ生成AngⅡ; ACE2主要的作用是水解的AngⅠ和AngⅡ的C端的一个肽链,分别生成Ang(1-9)和Ang-(1-7), Ang-(1-9)在ACE的水解作用下,进一步生成Ang-(1-7)。Ang-(1-9)的功能目前鲜有报道。因为ACE水解Ang-(1-9)生成Ang-(1-7)的量非常少,Ang-(1-7)主要是由ACE2水解AngⅡ产生的,因此ACE2是Ang-(1-7)生成的关键酶。Ang-(1-7)的受体Mas,是属于视紫质样的A类的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCR)亚家族,含有G蛋白偶联受体共有的非常保守三级结构,即7个疏水跨膜结构域。Ang-(1-7)通过与Mas受体作用,有舒张血管、利尿、降低血压等调节体液平衡和血压的作用。新近报道,除了全身RAS系统外,各个组织和器官内也存在RAS系统,即局部RAS系统。局部组织和器官内AngⅡ生成增多,参与细胞增殖、炎症反应、能力代谢和细胞转移等。与AngⅡ的作用相反,Ang-(1-7)可抑制心肌肥大、血管平滑肌的增生、抑制炎症等。进一步的研究也发现,Ang-(1-7)可以抑制丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(Mitogen-activated protein kinase)、环氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)活性,抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达或降低癌细胞对胸腺嘧啶的摄入抑制DNA复制等抑制肺癌A549细胞和前列腺癌PC3细胞的增殖。在肿瘤转移方面,Ang-(1-7)可以抑制前列腺癌PC3细胞和肺癌A549细胞转移。可见,ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴具有抗肿瘤的作用。新近在国际权威期刊Cancer research上报道,Ang-(1-7)可以通过抑制癌旁纤维化而抑制乳腺癌的生长,说明ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴可能对乳腺癌的发生发展也可能有抑制作用。那么,ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对乳腺癌转移是否有抑制作用?目前鲜有报道。Qingyun Li等发现,ACE2蛋白可以抑制转录因子ZEB1、TWIST1和Snaill蛋白水平而上调肿瘤转移抑制蛋白E-cadherin蛋白来抑制非小细胞肺癌的转移。Ang-(1-7)也可以上调肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白表达。提示,ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴可能通过上调E-cadherin蛋白抑制乳腺癌的转移。钙库操作性Ca2+内流(store-operated calcium entry, SOCE)广泛存在于非兴奋性和兴奋性细胞中,是介导细胞外Ca2+进入细胞内的主要通道之一。SOCE通路主要由位于细胞膜上的Ca2+通道Orail蛋白和内质网上的感受Ca2+浓度变化的基质相互作用分子1(Stromal interaction moleculel, Stiml)蛋白共同构成。当Stiml感受到内质网内钙库Ca2+消耗后,Stiml蛋白发生偶联并活化膜上钙通道Orail蛋白,形成内向的Ca2+流以补充消耗的Ca2+,这对于维持细胞内的Ca2+稳态有着至关重要的作用,同时也保证了细胞内Ca2+传递的准确性。SOCE介导的外Ca2+内流可以调节细胞能量代谢、细胞骨架运动、细胞片足的形成等促进细胞的转移。敲低乳腺癌MDA-MB-231细胞Stiml蛋白和Orail蛋白抑制细胞的转移：而在低转移能力的乳腺正常上皮细胞MCF-10A过表达Stiml蛋白和Orail蛋白,可促进其转移。更有趣的是,SOCE还介导了肿瘤细胞EMT的发生,通过激活Snaill而抑制E-cadherin表达。可见,SOCE介导的外Ca2+内流不仅可以通过调控细胞运动,也可以通过下调肿瘤转移抑制蛋白E-cadherin蛋白表达增强细胞的转移能力。既往有研究报道,Ca2+激活的NF-kB通路可以促进Snaill表达,而Ca2+活化的p21激活激酶1(p21 activated kinase 1, PAK1)可以激活Snaill核转位。提示,SOCE介导的外Ca2+内流可能通过激活NF-kB/PAKI/Snaill通路下调E-cadherin蛋白表达。在心血管研究中发现,AngⅡ可以激活SOCE参与平滑肌的增生,那么AngⅡ内源性的抑制剂Ang-(1-7)对SOCE作用如何?ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴上调E-cadherin蛋白表达是作用是否与SOCE有关?目前尚不清楚。研究目的1.探讨ACE2蛋白表达水平和乳腺癌转移的关系,进一步明确ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对E-cadherin蛋白表达和乳腺癌转移的影响。2.探讨乳腺癌细胞中,SOCE对E-cadherin表达变化调节的作用和机制。3.明确ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对乳腺癌细胞SOCE的影响。研究方法1.选取3个高转移能力的乳腺癌细胞系(BT54、ZR-75-30和MDA-MB-231)及3个低转移能力的乳腺癌细胞系(BT474、T-470和MCF-7), western blot不同细胞系的检测ACE2蛋白水平。在低表达ACE2蛋白的MDA-MB-231细胞中,慢病毒转染过表达ACE2蛋白；在高表达ACE2的MCF-7细胞系中,用shRNA质粒转染敲低ACE2蛋白或者Mas受体抑制剂A-779处理细胞。在构建好的稳定细胞系中,用划痕实验检测其迁移能力的变化、transwell检测其侵袭能力的变化,明确ACE2蛋白和乳腺癌细胞转移的关系。2.用Ang-(1-7)处理MDA-MB-231细胞,划痕实验检测其迁移能力的变化、transwell检测其侵袭能力的变化,明确Ang-(1-7)对MDA-MB-231细胞转移能力的影响。并用Mas受体抑制剂A-779预处理细胞,观察是否可以阻断Ang-(1-7)的作用。3.提取过表达或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌细胞或Ang-(1-7)处理的乳腺癌细胞系蛋白,检测E-cadherin蛋白和转录因子(ZEB1、TWIST1和Snaill)蛋白表达的变化。进一步检测核蛋白中NF-kB及Snail1、胞浆蛋白中PAK1磷酸化的水平；免疫荧光检测NF-kB及Snaill核转位。4.用绿色荧光染料Fluo-4/AM染色细胞内钙离子,钙内流影像图用FV10-ASW 1.7 viewer软件在激光共聚焦显微镜下记录,观察和比较高转移能力的MDA-MB-231细胞和低转移能力的MCF-7细胞中SOCE介导的外钙内流水平。免疫荧光双染Stiml和Orai1、Co-IP检测Stiml和Orail复合物的水平,评价MDA-MB-231细胞和MCF-7中细胞Stiml和Orail相互作用的情况。5.用SOCE抑制剂2-APB、SKF96365和钙离子螯合剂EGTA处理MDA-MB-231细胞,划痕实验观察细胞迁移变化及Transwell实验观察侵袭的变化；Fluo-4/AM染色细胞内钙离子,confocal检测细胞SOCE;免疫荧光双染Stiml和Orai1、Co-IP检测上述处理的乳腺癌细胞系中Stiml和Orail复合物的变化；vestern blot检测E-cadherin和转录因子(Snaill)蛋白表达、核蛋白中NF-kB及Snaill、胞浆蛋白中PAK1磷酸化的水平；免疫荧光检测NF-kB及Snaill核转位。6.用绿色荧光染料Fluo-4/AM染色细胞内钙离子,钙内流影像图用FV10-ASW 1.7 viewer软件在激光共聚焦显微镜下记录,观察过表达或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌细胞系或者Ang-(1-7)处理的乳腺癌细胞系SOCE的变化。免疫荧光双染Stiml和Orail、Co-IP检测上述处理的乳腺癌细胞系中Stiml和Orail复合物的变化。7.收集乳腺癌病人临床资料,包括年龄、肿瘤分期、临床分期等,和手术标本切片,包括原位癌癌旁组织、原位癌组织、发生转移的癌组织、转移到淋巴结的癌组织。免疫组化检测ACE2蛋白水平,并分析ACE2蛋白水平和临床分期的关系。8.裸鼠实验：6-8周龄裸鼠随机分为四组,鼠尾静脉注射1×106个细胞过表达或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌细胞系,6周后获取肺组织行包埋、切片、HE染色,观察肺组织转移结节的数量。9.统计分析：采用SPSS13.0统计分析软件进行数据资料的统计分析。对于计量数据资料用Shapiro-Wilk法进行数据的正态性检验,符合正态分布的计量资料使用均数±标准差描述。两样本均数比较采用独立样本t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用q检验。计数资料率之间比较采用卡方检验,临床患者资料与及癌组织手术标本切片ACE2表达水平之间关系分析采用Fisher确切概率法。所有统计分析均为双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.不同转移能力的乳腺癌细胞系ACE2蛋白表达水平在高迁移和侵袭能力的乳腺癌细胞系BT549, ZR-75-30、MDA-MB-231中ACE2蛋白表达显著低于迁移和侵袭能力较低的乳腺癌细胞系BT474、T-470、MCF-7,两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。2.构建稳定过表达ACE2的MDA-MB-231细胞及稳定敲低ACE2蛋白的MCF-7细胞慢病毒转染后,MDA-MB-231细胞ACE2蛋白表达较lenti-NC组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。MCF-7细胞转染shNC质粒及shACE2质粒后,四个shACE2都能抑制MCF-7细胞ACE2蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)；但以shACE2#2的效果最为明显,以下实验均以转染shACE2#2的MCF-7细胞进行实验。3. ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对乳腺癌细胞迁移和侵袭的作用过表达ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力,差异有统计学意义(P<0.05)；A-779可以抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增强MCF-7细胞的迁移和侵袭能力,差异有统计学意义(P<0.05)。4. ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对转录因子ZEB1、TWIST1和Snaill表达水平的影响过表达ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231细胞中ZEB1、TWIST1和Snaill蛋白水平,敲低ACE2蛋白增加MCF-7细胞ZEB1、TWIST1和Snaill蛋白水平。但是以Snaill蛋白水平改变最为明显。5. ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对NF-kB/PAKl/Snaill通路的影响过表达ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231细胞中抑制核蛋白NF-kB及Snaill的水平、减少PAK1磷酸化及Snaill蛋白表达,上调E-cadherin蛋白表达；A-779可以抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增加MCF-7细胞核蛋白中NF-kB及Snaill的水平、增加PAKl磷酸化及Snaill蛋白表达,下调E-cadherin蛋白表达。6. SOCE 对 NF-kB/PAKl/Snaill通路的影响MDA-MB-231细胞SOCE介导的钙内流较MCF-7细胞高。MDA-MB-231细胞中NF-kB及Snaill核转位、PAK1磷酸化、Snaill蛋白表达水平较较MCF-7细胞高。SOCE抑制剂2-APB、SKF96365可抑制TG诱导的钙内流,减少Stiml和Orail复合物形成,钙离子螯合剂EGTA可细胞内钙的水平；2-APB、SKF96365和EGTA可以下调MDA-MB-231细胞中NF-kB及Snaill核转位、PAK1磷酸化、Snaill蛋白表达水平,增加E-cadherin蛋白表达。7. ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴对SOCE的影响过表达ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制/IDA-MB-231细胞的SOCE介导的外钙内流,抑制Stiml和Orail复合物形成；A-779可以抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增强MCF-7细胞的SOCE介导的钙内流;增加Stiml和Orail复合物形成。8.不同临床分期的乳腺癌手术标本中ACE2蛋白原位癌癌旁组织中ACE2蛋白表达水平较原位癌高,发生转移的乳腺癌组织及转移到淋巴结中的癌组织中ACE2蛋白表达低于原位癌组织ACE2蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。9.裸鼠实验检测ACE2蛋白对乳腺癌体内转移的影响鼠尾静脉注射过表达ACE2的MDA-MB-231细胞的裸鼠,其肺组织中癌结节数量明显少于较对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；鼠尾静脉注射敲低ACE2蛋白的MCF-7细胞,其肺组织中的癌结节明显多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论1. ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴可抑制乳腺癌转移,其机制是通过抑制NF-kB/ PAK1/Snaill通路活性,减少Snaill对E-cadherin蛋白表达的抑制作用。2. SOCE介导的钙内流可以激活NF-kB/PAK1/Snaill通路,进而抑制E-cadherin蛋白表达,促进乳腺癌细胞转移。3. ACE2/Ang-(1-7)/Mas受体轴可能是通过抑制SOCE活性来抑制NF-kB/ PAK1/Snaill通路。