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构建组织工程肺(lung tissue engineering,LTE)首先需要获取理想的组织工程支架,通过种植宿主细胞,在生物反应器中进行培养,最后移植到宿主体内,形成一个具有气体交换功能的“人工肺”,为肺移植带来了新的方向,具有光明的前景。理想的去垢剂制备的脱细胞肺支架(decellularized lung scaffold,DLS)能够充分的去除肺内细胞,同时最大程度的保留细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白,无免疫原性,同时提供组织生长的三维(three dimensional,3D)结构,这对接下来的体外细胞培养和体内移植有着重要的意义。传统的去垢剂如脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SDC)和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS),作用较强,ECM蛋白破坏严重,使ECM丧失了天然结构和功能,影响细胞化和血管化,同时呼吸膜破严重,影响气体交换。这些去垢剂可能更适于心脏和肾脏等致密器官的脱细胞,对于肺脏这种结构疏松的器官可能不太适合。新型去垢剂十二烷基醚硫酸钠(sodium lauryl ether sulfate,SLES)易溶于水,具有优良的去污能力、生物降解性和低温性能,化学特性温和,理论上SLES用于肺的脱细胞可能更有优势。基于这一理论基础,我们提出假设SLES可以用来制备脱细胞肺支架,对比SDC和SDS制备的脱细胞肺支架,细胞去除更干净、ECM结构和蛋白保留更完整。在自制生物反应器内进行A549细胞培养3天,SLES肺支架内细胞种植的效果最好。同种异体皮下移植SLES肺支架的生物相容性最好、细胞浸润和血管形成能力最好。最终探索出一种理想的去垢剂、最佳的脱细胞方法、合适的细胞种植方法,为组织工程肺早日应用于临床提供研究基础。第一部分三种去垢剂制备脱细胞肺支架目的:采用langendorff灌注系统主要灌注三种去垢剂SDC、SDS和SLES,制备出三种脱细胞肺支架,探索脱细胞的方法。方法:SD大鼠取肺,经主肺动脉插入16G灌注针头,悬挂在Langendorff灌注台上,主要灌注三种去垢剂SDC、SDS和SLES,联合核酸酶应用液,制备出三种脱细胞肺支架。通过大体观察、组织学染色、免疫荧光染色、扫描电镜、DNA含量测定、硫酸化糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycans,sGAG)含量测定、Western blot来评价脱细胞的效果。结果:制备的三种肺支架,几乎均呈现白色透明状,SLES肺支架的形态结构变化不大。组织学染色显示三种肺支架无残留的细胞和细胞核,SLES肺支架内的胶原纤维、弹性纤维、糖胺聚糖保留较SDC和SDS完整,染色评分更高。免疫荧光染色显示胶原蛋白Ⅳ、胶原蛋白Ⅰ、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白在SLES肺支架内保留的最完整,荧光平均强度最高。扫描电镜显示SDC肺支架与SDS肺支架的表面和内部结构松散、组织的间隙增大,SLES肺支架保留了新鲜肺组织的紧密结构。DNA含量结果显示三种肺支架均小于<50ng/每mg干重组织,其中,SLES肺支架的DNA的去除率达到96.32%。sGAG含量结果显示SLES肺支架内的含量最高,显著高于SDC肺支架与SDS肺支架内含量。Western blot显示β-actin和GAPDH在三种肺支架内均不表达,SLES肺支架的胶原蛋白Ⅳ、层粘连蛋白、弹性蛋白的表达量最高,显著高于SDC肺支架与SDS肺支架内含量。结论:1.langendorff离体灌流系统制备大鼠肺的脱细胞肺支架切实可行,是一种简单易行的脱细胞方法。2.我们首次报道了一种新型去垢剂SLES用于脱细胞肺支架的制备,SLES可以有效地去除肺内细胞。3.与SDC、SDS脱细胞肺支架相比,SLES脱细胞肺支架内的ECM结构和蛋白保留的最为完整。4.去垢剂-核酸酶脱细胞方法可以有效地去除细胞,同时最大程度的保留ECM成分,我们的脱细胞方法效果良好。第二部分生物反应器内细胞培养目的:三种脱细胞肺支架内种植A549细胞,在自制简易的生物反应器中培养3天,评价种子细胞的粘附、增殖和凋亡情况。方法:A549作为种子细胞,培养、提取、计数,将40 X106个细胞稀释到10ml的DMEM/F12(1:1,HyClone)培养基中。用注射器把培养基经主支气管注入到支架内,静置2h后连接生物反应器培养3天。通过H&E染色、DAPI、Ki67和TUNEL荧光染色、DNA定量来评价A549细胞种植效果。结果:H&E染色和DAPI染色可见SLES肺支架内A549细胞生长速度最快,细胞均匀分布。Ki67染色显示A549细胞基本均处于增殖,TUNEL染色显示极少的凋亡细胞。DNA定量结果显示SLES肺支架中DNA含量最高,恢复至新鲜肺的66.92%,SDS肺支架内DNA含量最低,仅恢复至新鲜肺的47.39%。结论:1.我们自制的生物反应器可以有效地促进种子细胞的生长、浸润。2.通过支气管注射种植种子细胞是一种可行的细胞种植方式。3.与SDC、SDS脱细胞肺支架相比,A549细胞种植在SLES脱细胞肺支架内,在生物反应器中培养3天,可以看到细胞增殖最快,浸润至肺泡远端,DNA含量最高。第三部分脱细胞肺支架同种异体皮下移植目的:三种脱细胞肺支架同种异体皮下移植6周,观察移植物与宿主的生物相容性,有无排斥反应,细胞浸润及血管生长情况。评价三种肺支架在体内移植的效果。方法:三种脱细胞肺支架无菌条件下剪下2cm×2cm的组织。SD大鼠戊巴比妥钠20mg/kg腹腔内注射麻醉。背部皮下包埋脱细胞肺组织。6周后取出组织。进行:大体观察、H&E染色、Masson染色、DAPI和CD68荧光染色、细胞计数和血管直径定量比较。结果:三种移植物均没有出现排斥、脱落、卷曲、隆起、血栓形成等情况,SLES移植物与周围组织融合的最好,边界基本融为一体。H&E染色和DAPI染色可见SLES移植物有最多的细胞浸润,细胞分布较为平均。SDC移植物与SDS移植物内细胞浸润较少,主要是分布在新生血管周围。Masson染色可见SLES移植物内新生血管数量最多,直径最大。CD68荧光染色可见三种移植物内均有CD68表达,SDC移植物内较多,SDS移植物和SLES移植物内均较少。结论:1.同种异体皮下移植6周,三种脱细胞肺支架均没有出现排斥反应,显示出良好的生物相容性,均有细胞浸润及新生血管形成。2.与SDC、SDS脱细胞肺支架相比,SLES脱细胞肺支架皮下移植后细胞浸润数量最多,分布更均匀,新生血管数量更多,直径最大,显示出更好的效果。