猪苓是我国传统的名贵药材,地下部分的菌核即中药猪苓,具有利水渗湿的功效。目前,对于猪苓的研究主要集中在菌核的栽培技术、菌丝的培养与优化、有效成分的含量差异和药理活性、人工培养菌丝形成菌核的生理条件和分子机制等方面。但是由于猪苓菌核发育历程缓慢,且对环境条件要求相对严苛,猪苓菌核的发育研究一直停留在结构和发育史、功能基因的克隆和表达分析,其发育历程和代谢过程的分子机制研究相对滞后。本研究通过对黑苓表皮黑色素的提取纯化和理化性质的分析,确定了菌核发育中表皮颜色变化的原因是黑色素的沉积,并通过对猪苓不同时期菌核的转录组数据进行分析,挑选出影响猪苓菌核发育的差异表达基因,并结合有效成分的含量差异和代谢途径,初步阐明了猪苓菌核的发育历程和代谢过程的分子机制。主要结论如下:1.从黑苓表皮中提取纯化了黑色素,并对其理化性质进行了分析。结果表明,猪苓菌核表皮黑色素不溶于水和常见的有机溶剂,在酸性溶液中沉淀,溶于碱性溶液;不具有鞣质和黄酮类物质的特性,能被氧化剂漂白,含有大量酚羟基;在200-800nm范围内,吸光值随波长增加呈指数型下降,以波长对吸光值取对数作图,斜率为负数;具有-OH、脂肪族-CH、芳香环中C=C和C=N骨架、羧酸外C=O、COO-等官能团。以上均为黑色素的共性。另外,黑色素对温度不敏感,对光照敏感,pH增大对其具有增色效应,低pH和冷冻对其具有减色效应;能清除羟自由基和超氧阴离子自由基,具有还原能力。综上,确定了猪苓菌核发育过程中表皮颜色变化的原因是黑色素的沉积。2.对白苓(BL)、灰苓(GL)和黑苓(HL)进行转录组测序。共获得587 381 230个clean reads,包含88.12Gb的核苷酸序列。对序列进行拼接组装,共得到85 235条unigene。根据DEGs的富集结果,发现白苓时期的有氧呼吸相对于灰苓和黑苓表达较弱,电子转移相关的黄素蛋白脱氢酶活性降低,推测白苓在自然环境下由于受到温差等环境刺激,导致自身形成氧化应激状态。筛选出发育相关的DEGs,进一步推测BL通过高表达膜转运蛋白和麦角甾醇,保证机体活跃的物质交换、信息传递以及能量的生成与输出;通过高表达WD40蛋白,启动自身防御机制。在GL和HL中,通过上调表达小G蛋白RhoA和CYP450以及苯丙烷代谢,实现丝状菌丝的极性生长和形态发育;并且黑色素、1,3-β-葡聚糖和几丁质也随着猪苓菌核的发育而合成,实现猪苓菌核表皮颜色的黑化和细胞壁的加厚。3.对BL、GL和HL的猪苓多糖和麦角甾醇含量进行测定。结果显示,随着发育的成熟,多糖含量和麦角甾醇含量逐渐增加,但累计率降低。筛选到参与多糖合成的关键酶基因,包括HK、TNV、GPI、pgm、MPI、galU、UDGH、UXS1和GSase48等,大部分酶分布在多糖合成的上游途径,形成关键中间产物,推测猪苓多糖在菌核发育前期快速合成,随着发育成熟,合成速率降低;同样的,麦角甾醇合成酶ERG4和ERG5均下调表达,推测发育早期为响应外界刺激,加速合成麦角甾醇,以确保细胞膜行使物质跨膜运输的正常功能。这个结果为进一步解析猪苓多糖和麦角甾醇的合成途径提供帮助。