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枸杞子是我国药食同源的名贵中药材。枸杞多糖(Lycium barbarumL.Polysaccharide,LBP)是其主要活性成分之一,具有广泛的生物学活性。由于缺乏准确和灵敏的检测手段,LBP能否被胃肠道吸收以及如何被吸收、是否进入细胞以及如何进入细胞发挥生物学效应等相关问题都尚待研究。针对这些问题,本论文以热水浸提法制备LBP,并进一步分离出具有高免疫调节活性的高分子量枸杞多糖组分(HLBP);采用荧光染料标记LBP,追踪LBP的细胞摄取途径及胞内分布,并通过Caco-2细胞单层模型,初步研究了 LBP的吸收转运机制,实验结果如下:1.采用水提醇沉法提取LBP,多糖得率为5.03%。红外光谱显示LBP含有糖类的特征吸收峰。采用超滤法将LBP分为高分子量枸杞多糖组分(HLBP)和低分子量枸杞多糖组分(LLBP)并测定其分子量为别27.71 kDa和6.99kDa。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-柱前衍生高效液相色谱法进行单糖组成鉴定:结果显示HLBP和LLBP的单糖组成种类相似,但单糖的摩尔百分比明显不同,HLBP主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖构成,摩尔百分比分别为45.86%、22.09%和19.30%,葡萄糖是LLBP的主要单糖,摩尔百分比为84.34%。苯酚-硫酸法测定HLBP和LLBP的总糖含量分别为29.6%±0.80%和16.25%±0.24%,Bradford法测定二者的蛋白含量分别为1.10%±0.03%和 0.65%±0.14%。2.CCK-8实验结果表明,HLBP能显著提高RAW264.7巨噬细胞的细胞活力,但对测试的肿瘤细胞和正常细胞影响较小;HLBP诱导RAW264.7细胞形态改变,包括细胞体积、细胞核变大以及细胞中线粒体数量增加;HLBP能显著促进RAW264.7细胞NO、ROS、TNF-α及IL-6的产生,激活细胞免疫应答,也能抑制脂多糖(LPS)诱导细胞产生NO、ROS、TNF-α及IL-6,并且诱导RAW264.7细胞向M1、M2型极化。这些结果提示HLBP可能通过调节M1/M2型的比例而双向调节RAW264.7细胞中NO、ROS、TNF-α及IL-6的分泌,LLBP则没有表现出免疫调节活性。3.通过异硫氰酸酯键与LBP中氨基的反应,实现了对LBP的荧光标记,荧光标记产物LBP-荧光素(LBP-F)和LBP-罗丹明(LBP-RB)的荧光团取代度分别为0.86%和1.45%。细胞摄取实验表明,LBP-F和LBP-RB可内化进入多种细胞,并定位于溶酶体中;内化通路抑制实验表明LBP-F和LBP-RB可通过网格蛋白介导的内吞途径、吞噬途径及巨胞饮等多种途径内化到RAW264.7细胞中。4.建立了 Caco-2细胞单层模型评估LBP的跨膜转运能力,结果表明不同浓度的LBP-F在0至240 min内持续转运通过Caco-2细胞单层,其Papp值介于(2.14±0.17)× 10-6 cm/s～(5.88±0.35)× 10-6 cm/s之间,相当于口服利用率为20%～70%。内吞抑制剂氯丙嗪可降低LBP-F的跨膜转运量和Papp值,表明网格蛋白参与了 LBP的跨膜转运。综上所述,LBP活性组分(HLBP)具有免疫调节活性,荧光标记产物LBP-F可被细胞摄入并通过小肠内皮细胞吸收,这些结果为阐明LBP的体内吸收和代谢途径以及分子作用机制奠定了基础。