pH恒稳态是植物正常生长和发育的必要条件,也是植物细胞生命过程中的重要信号,在许多信号转导中起重要的调控作用。真核生物V-ATPase作为质子泵在维持细胞内pH平衡方面具有重要作用。植物V-ATPase定位在液泡膜和其他一些分泌系统膜上,包括内质网(ER)、高尔基体和一些小囊泡。V-ATPase主要功能是通过催化ATP水解使液泡酸化,进而提供离子和代谢物转运所需要的能量。V-ATPase B亚基是V-ATPase的催化亚基之一,参与催化位点的形成,在ATP水解过程中起重要调控作用。本实验室研究表明V-ATPase B亚基是一个微丝结合蛋白,在微丝动态变化过程中起重要调控作用。但是,V-ATPaseB亚基调控植物生长发育过程的机制机理仍未有报道。因此,研究V-ATPaseB亚基的生理功能对于揭示植物生长发育过程具有非常重要的意义。本文主要以拟南芥为研究材料,对V-ATPaseB亚基家族三个成员(AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3)进行生理功能研究,主要成果如下:1.通过RT-PCR分析鉴定,T-DNA插入突变体vab1、vab2、vab3株系在转录水平基因的表达量无显著抑制,生理实验分析表明突变体株系与Columbia野生型拟南芥相比在生长发育过程中无表型差异。2.将AtVABl、AtVAB2和AtVAB3 CDS序列融合到绿色荧光蛋白(GFP)序列5’端并用自身启动子驱动基因表达,该载体转染到野生型拟南芥中,筛选到纯合转基因株系。通过共聚焦显微镜观察AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3的亚细胞定位,初步确定均定位在液泡膜上。3.构建cDNA-RNAi载体,通过农杆菌介导转染到野生型拟南芥中对目的基因进行干扰。RT-PCR分析鉴定表明cDNA-RNAi转基因株系中AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3基因的表达量受到显著抑制。4.体外花粉萌发研究表明cDNA-RNAi转基因株系与野生型拟南芥相比花粉萌发率和花粉管长度显著降低。野生型拟南芥花粉萌发率和花粉管长度随时间逐渐增加,而cDNA-RNAi转基因株系花粉在萌发2小时后,花粉萌发率和花粉管长度不再发生显著变化。5.微丝解聚药物Lactrunculin(LatB)处理cDNA-RNAi转基因株系花粉,发现与野生型拟南芥相比转基因株系花粉萌发率表现出对LatB敏感表型,而花粉管长度未表现出对Lat B敏感表型。6.亚历山大染色表明cDNA-RNAi转基因株系的花粉活性并未发生变化。苯胺蓝染色研究发现cDNA-RNAi转基因株系与野生型相比花粉萌发率未有显著差异,而花粉管长度与野生型相比变短。7.通过构建过表达载体转染拟南芥,筛选到纯合转基因株系(OE-VAB1)。发现过表达纯合株系的幼苗重量增加、植物丧失顶端优势以及对盐胁迫敏感等表型。综上所述,本实验利用分子生物学、遗传学和细胞生物学等方法证明了V-ATPase B亚基在调控植物生长发育、花粉管生长以及响应盐胁迫信号通路等方面具有重要作用。