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成年哺乳动物脑大部分神经元产生于胚胎期和出生后早期。然而，在整个生命期，始终存在两个重要新生神经元发生区：侧脑室室下区（lateral ventricle-subventricular zone，LV-SVZ）和海马齿状回颗粒下层（subgranular Zone，SGZ）。室管膜细胞为衬附在脑室内面具有纤毛形态的一层细胞，因与SVZ临近被认为具有神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的属性。CD133/Prominin-1是细胞表面含5次跨膜结构的糖蛋白分子，在分离小鼠神经干细胞时被发现，它也表达在多种组织干细胞和肿瘤干细胞中。正常情况下，CD133标记的成体室管膜细胞具有静态神经干细胞属性，其广泛分布于脑室的室管膜下区（subependymal zone，SEZ）和SVZ中，在受到缺血或损伤等刺激之后能够增殖、迁移至邻近区并分化为中间神经元。SVZ中的神经干细胞或通过对称性细胞分裂产生双子代干细胞，或通过不对称细胞分裂产生一个干细胞和一个神经前体细胞（neural precursor cells，NPCs）。由于老龄或包括阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）和帕金森病（Parkinsons disease，PD）在内的神经退行性疾病在其发病早期SVZ和SGZ中NSCs再生能力均下降并伴有记忆或运动功能减退，因此通过调控NPCs再生相关因素可改善老龄动物记忆功能或达到早期预防和治疗AD或PD的目的。
Notch信号通路对哺乳动物脑的发育、胚胎和成体NSCs的再生起着重要的调控作用。经典Notch信号通路中包括四种Notch受体、五种Notch配体和细胞内效应器分子（RBP-J-DNA结合蛋白）。Notch为膜结合受体，当配体与Notch受体结合后引起蛋白水解过程，Notch释放出胞内片段——NICD，后者转位至核内，与RBP-J结合形成复合物，引起RBP-J依赖的转录因子的激活。NICD-RBP-J复合物的靶基因包括Hes1，因此NICD-RBP-J诱导了Hes1等基因的转录。当缺乏Notch和NICD时，即在Notch信号失活的情况下，RBP-J会结合至DNA成为阻遏复合物的一部分，此时可诱导NSCs的分化。由于四种Notch受体、NICD和阻遏复合物最终都能竞争性地结合RBPJ，故而RBPJ在经典的Notch信号通路中起关键性调控作用。鉴于Notch信号通路对神经细胞的重要调控作用以及RBP-J在Notch信号通路中的关键作用，且有文献报道RBP-J可以调控海马齿状回细胞的增殖与分化作用，因此猜测RBP-J可能在室管膜细胞的调控中也起着十分重要的作用。
目的：
本研究旨在明确RBP-J对侧脑室CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的影响及其可能的分子机制。
方法：
本研究分为两个部分，第一部分通过形态学的方法研究RBP-J对CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的影响：首先在细胞层面，通过提取孕12d的ICR小鼠的胚胎前脑侧脑室室管膜区，剪碎并轻轻吹打制成细胞悬液，400目滤网过筛后离心收集细胞，随机分为4组：RBP-J-siRNA+Lipo2000组、Control-siRNA+Lipo2000组、Lipo2000组、空白对照组。在细胞贴壁后的第3d，按照如上分组给予干扰：将12μl10pm浓度的RBP-J-siRNA与6μl Lipo2000室温混合并静置15min后加入RBP-J-siRNA+Lipo2000组，将12μl10pm浓度的Control-siRNA与6μl Lipo2000室温混合并静置15min后加入Control-siRNA+Lipo2000，将12μl RNA-Free水与6μl Lipo2000室温混合并静置15min后加入Lipo2000组，然后于第5、7、12进行免疫荧光细胞染色，观察DCX（未成熟神经元marker）/CD133-，β-TublinⅢ（NPCs定向分化marker）/CD133-，MAP2（成熟神经元marker）/CD133-，PCNA（细胞增殖marker）/CD133-双阳性细胞数目的变化情况。其次在动物层面，将2~3月龄体重为20-25g的成体CD133-CreERTM∷ROSA26-LacZ诱导条件性基因敲除小鼠作为对照组（Control组），将2-3月龄体重为20-25g的成年CD133-CreERTM∷ROSA26-LacZ∷RBP-Jflox/flox诱导条件性基因敲除RBP-J的小鼠作为实验组（RBP-J cKO组）。在连续5天腹腔注射他莫西酚（tamoxifen，TAM）通过免疫荧光染色等方法观察侧脑室区DCX（未成熟神经元marker）/β-Gal-，β-TublinⅢ（NPCs定向分化marker）/β-Gal-，NeuN（成熟神经元marker）/β-Gal-，PCNA（细胞增殖marker）/β-Gal-双标阳性细胞数目的变化情况。
第二部分通过分子生物学手段探究RBP-J影响CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的分子机制：首先在细胞层面，通过提取孕12d的ICR小鼠的胚胎前脑侧脑室室管膜区，剪碎并轻轻吹打制成细胞悬液，400目滤网过筛后离心收集细胞，随机分为4组：RBP-J-siRNA+Lipo2000组、Control-siRNA+Lipo2000组、Lipo2000组、空白对照组，提取原代细胞总蛋白、总mRNA分别进行Western Blot、实时荧光定量PCR后结合第一部分结果来探究RBP-J对小鼠原代的CD133阳性室管膜细胞增殖与分化作用的分子机制。其次在动物层面，用2-3月龄体重为20-25g的成年CreERTM∷ROSA26-LacZ诱导条件性基因敲除小鼠为对照组（Control组），将2-3月龄体重为20-25g的成年CreERTM::ROSA26-LacZ∷RBP-Jflox/flox诱导条件性基因敲除小鼠作为实验组（RBP-J cKO组），提取前脑侧脑室室管膜区总蛋白、总mRNA分别进行Western Blot、实时荧光定量PCR，并结合第一部分结果来探究RBP-J影响小鼠侧脑室的CD133阳性室管膜细胞增殖与分化作用的分子机制。
结果：
1、通过免疫荧光染色发现体外培养3d的CD133染色阳性室管膜细胞呈现神经球，并表达Nestin，表明胚胎前脑的侧脑室CD133阳性室管膜细胞为神经干细胞。通过Hoechst/CD133免疫荧光染色表明体外培养0d的CD133阳性室管膜细胞数占细胞总数的90%左右，因此认为提取的原代细胞大部分是侧脑室中的CD133阳性室管膜细胞。
2、通过PCR技术进行诱导条件性基因敲除小鼠的基因鉴定后，采用免疫荧光技术发现RBP-J cKO组与对照组的RBPJ表达量有显著差异，证明小鼠的RBP-J基因成功被敲除。
3、在用RBP-J-siRNA干扰RBP-J后体外培养5d的CD133染色阳性室管膜细胞DCX/CD133-、体外培养7d的CD133染色阳性室管膜细胞β-TublinⅢ/CD133-、体外培养10d的CD133染色阳性室管膜细胞NeuN/CD133-和体外培养3d、5d和10d的CD133染色阳性室管膜细胞PCNA/CD133-双阳性细胞数目明显高于Control-siRNA+Lipo2000、Lipo2000、空白对照组，结果表明在原代细胞培养的CD133阳性细胞中干扰RBP-J后会引起原代细胞培养的CD133阳性室管膜细胞分化与增殖情况的增加。
4、诱导条件性基因敲除RBP-J小鼠侧脑室的CD133阳性室管膜细胞在敲除了RBP-J后免疫荧光染色结果显示DCX/β-Gal-、β-TublinⅢ/β-Gal-、NeuN/β-Gal-和PCNA/β-Gal-双阳性细胞数目明显高于未敲除的空白对照组。
5、为了研究干扰RBP-J是如何影响原代细胞培养的CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的，采用实时荧光定量PCR、Western Blot实验探究Notch信号通路下干扰掉RBP-J后RBP-J、Notch1、Hes1的mRNA表达量的变化，最终发现，RBP-J-siRNA+Lipo2000与Control-siRNA+Lipo2000、Lipo2000、空白对照组这3组相比，RBP-J-siRNA+Lipo2000组的RBP-J、Hes1mRNA表达量显著下降，有趣的是Notch1（NICD）mRNA、蛋白的表达量显著上调。
6、为了进一步验证RBP-J是如何影响CD133阳性室管膜细胞增殖和分化，对诱导条件性基因敲除RBP-J小鼠采用实时荧光定量PCR、Western Blot实验探究Notch信号通路下干扰掉RBP-J后RBP-J、Notch1、Hes1的mRNA表达量的变化。最终发现，RBP-J cKO组与对照组相比，RBP-J cKO组的RBP-J、Hes1mRNA表达量显著下降，有趣的是Notch1mRNA、蛋白的表达量显著上调。
结论：
采用原代培养和条件性基因小鼠的研究结果表明，RBP-J在CD133阳性室管膜细胞增殖和分化中扮演着十分重要的角色。RBP-J的敲除促进了不成熟的NPCs、成熟神经元数量的比例增加，同时这些细胞的增殖比例也明显增加，这意味着静息状态的成体CD133阳性室管膜细胞在RBP-J基因敲除后，出现了明显增殖的动态变化，并向不成熟的NPCs与成熟的神经元分化。而real-time PCR和Western Blot的结果均显示，RBP-J、Hes1的mRNA与蛋白的表达量均下调，而Notch1表达量上调，因此认为CD133阳性室管膜细胞的增殖和分化，可能是因为受到Notch信号通路的Notch1/RBP/J-Hes1的调控。
Notch信号通路对哺乳动物脑的发育、胚胎和成体NSCs的再生起着重要的调控作用。经典Notch信号通路中包括四种Notch受体、五种Notch配体和细胞内效应器分子（RBP-J-DNA结合蛋白）。Notch为膜结合受体，当配体与Notch受体结合后引起蛋白水解过程，Notch释放出胞内片段——NICD，后者转位至核内，与RBP-J结合形成复合物，引起RBP-J依赖的转录因子的激活。NICD-RBP-J复合物的靶基因包括Hes1，因此NICD-RBP-J诱导了Hes1等基因的转录。当缺乏Notch和NICD时，即在Notch信号失活的情况下，RBP-J会结合至DNA成为阻遏复合物的一部分，此时可诱导NSCs的分化。由于四种Notch受体、NICD和阻遏复合物最终都能竞争性地结合RBPJ，故而RBPJ在经典的Notch信号通路中起关键性调控作用。鉴于Notch信号通路对神经细胞的重要调控作用以及RBP-J在Notch信号通路中的关键作用，且有文献报道RBP-J可以调控海马齿状回细胞的增殖与分化作用，因此猜测RBP-J可能在室管膜细胞的调控中也起着十分重要的作用。
目的：
本研究旨在明确RBP-J对侧脑室CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的影响及其可能的分子机制。
方法：
本研究分为两个部分，第一部分通过形态学的方法研究RBP-J对CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的影响：首先在细胞层面，通过提取孕12d的ICR小鼠的胚胎前脑侧脑室室管膜区，剪碎并轻轻吹打制成细胞悬液，400目滤网过筛后离心收集细胞，随机分为4组：RBP-J-siRNA+Lipo2000组、Control-siRNA+Lipo2000组、Lipo2000组、空白对照组。在细胞贴壁后的第3d，按照如上分组给予干扰：将12μl10pm浓度的RBP-J-siRNA与6μl Lipo2000室温混合并静置15min后加入RBP-J-siRNA+Lipo2000组，将12μl10pm浓度的Control-siRNA与6μl Lipo2000室温混合并静置15min后加入Control-siRNA+Lipo2000，将12μl RNA-Free水与6μl Lipo2000室温混合并静置15min后加入Lipo2000组，然后于第5、7、12进行免疫荧光细胞染色，观察DCX（未成熟神经元marker）/CD133-，β-TublinⅢ（NPCs定向分化marker）/CD133-，MAP2（成熟神经元marker）/CD133-，PCNA（细胞增殖marker）/CD133-双阳性细胞数目的变化情况。其次在动物层面，将2~3月龄体重为20-25g的成体CD133-CreERTM∷ROSA26-LacZ诱导条件性基因敲除小鼠作为对照组（Control组），将2-3月龄体重为20-25g的成年CD133-CreERTM∷ROSA26-LacZ∷RBP-Jflox/flox诱导条件性基因敲除RBP-J的小鼠作为实验组（RBP-J cKO组）。在连续5天腹腔注射他莫西酚（tamoxifen，TAM）通过免疫荧光染色等方法观察侧脑室区DCX（未成熟神经元marker）/β-Gal-，β-TublinⅢ（NPCs定向分化marker）/β-Gal-，NeuN（成熟神经元marker）/β-Gal-，PCNA（细胞增殖marker）/β-Gal-双标阳性细胞数目的变化情况。
第二部分通过分子生物学手段探究RBP-J影响CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的分子机制：首先在细胞层面，通过提取孕12d的ICR小鼠的胚胎前脑侧脑室室管膜区，剪碎并轻轻吹打制成细胞悬液，400目滤网过筛后离心收集细胞，随机分为4组：RBP-J-siRNA+Lipo2000组、Control-siRNA+Lipo2000组、Lipo2000组、空白对照组，提取原代细胞总蛋白、总mRNA分别进行Western Blot、实时荧光定量PCR后结合第一部分结果来探究RBP-J对小鼠原代的CD133阳性室管膜细胞增殖与分化作用的分子机制。其次在动物层面，用2-3月龄体重为20-25g的成年CreERTM∷ROSA26-LacZ诱导条件性基因敲除小鼠为对照组（Control组），将2-3月龄体重为20-25g的成年CreERTM::ROSA26-LacZ∷RBP-Jflox/flox诱导条件性基因敲除小鼠作为实验组（RBP-J cKO组），提取前脑侧脑室室管膜区总蛋白、总mRNA分别进行Western Blot、实时荧光定量PCR，并结合第一部分结果来探究RBP-J影响小鼠侧脑室的CD133阳性室管膜细胞增殖与分化作用的分子机制。
结果：
1、通过免疫荧光染色发现体外培养3d的CD133染色阳性室管膜细胞呈现神经球，并表达Nestin，表明胚胎前脑的侧脑室CD133阳性室管膜细胞为神经干细胞。通过Hoechst/CD133免疫荧光染色表明体外培养0d的CD133阳性室管膜细胞数占细胞总数的90%左右，因此认为提取的原代细胞大部分是侧脑室中的CD133阳性室管膜细胞。
2、通过PCR技术进行诱导条件性基因敲除小鼠的基因鉴定后，采用免疫荧光技术发现RBP-J cKO组与对照组的RBPJ表达量有显著差异，证明小鼠的RBP-J基因成功被敲除。
3、在用RBP-J-siRNA干扰RBP-J后体外培养5d的CD133染色阳性室管膜细胞DCX/CD133-、体外培养7d的CD133染色阳性室管膜细胞β-TublinⅢ/CD133-、体外培养10d的CD133染色阳性室管膜细胞NeuN/CD133-和体外培养3d、5d和10d的CD133染色阳性室管膜细胞PCNA/CD133-双阳性细胞数目明显高于Control-siRNA+Lipo2000、Lipo2000、空白对照组，结果表明在原代细胞培养的CD133阳性细胞中干扰RBP-J后会引起原代细胞培养的CD133阳性室管膜细胞分化与增殖情况的增加。
4、诱导条件性基因敲除RBP-J小鼠侧脑室的CD133阳性室管膜细胞在敲除了RBP-J后免疫荧光染色结果显示DCX/β-Gal-、β-TublinⅢ/β-Gal-、NeuN/β-Gal-和PCNA/β-Gal-双阳性细胞数目明显高于未敲除的空白对照组。
5、为了研究干扰RBP-J是如何影响原代细胞培养的CD133阳性室管膜细胞增殖和分化的，采用实时荧光定量PCR、Western Blot实验探究Notch信号通路下干扰掉RBP-J后RBP-J、Notch1、Hes1的mRNA表达量的变化，最终发现，RBP-J-siRNA+Lipo2000与Control-siRNA+Lipo2000、Lipo2000、空白对照组这3组相比，RBP-J-siRNA+Lipo2000组的RBP-J、Hes1mRNA表达量显著下降，有趣的是Notch1（NICD）mRNA、蛋白的表达量显著上调。
6、为了进一步验证RBP-J是如何影响CD133阳性室管膜细胞增殖和分化，对诱导条件性基因敲除RBP-J小鼠采用实时荧光定量PCR、Western Blot实验探究Notch信号通路下干扰掉RBP-J后RBP-J、Notch1、Hes1的mRNA表达量的变化。最终发现，RBP-J cKO组与对照组相比，RBP-J cKO组的RBP-J、Hes1mRNA表达量显著下降，有趣的是Notch1mRNA、蛋白的表达量显著上调。
结论：
采用原代培养和条件性基因小鼠的研究结果表明，RBP-J在CD133阳性室管膜细胞增殖和分化中扮演着十分重要的角色。RBP-J的敲除促进了不成熟的NPCs、成熟神经元数量的比例增加，同时这些细胞的增殖比例也明显增加，这意味着静息状态的成体CD133阳性室管膜细胞在RBP-J基因敲除后，出现了明显增殖的动态变化，并向不成熟的NPCs与成熟的神经元分化。而real-time PCR和Western Blot的结果均显示，RBP-J、Hes1的mRNA与蛋白的表达量均下调，而Notch1表达量上调，因此认为CD133阳性室管膜细胞的增殖和分化，可能是因为受到Notch信号通路的Notch1/RBP/J-Hes1的调控。