论文部分内容阅读
研究背景:AIM2(Absent in Melanoma 2,黑色素瘤缺乏因子2)是一种固有免疫受体。目前有研究指出AIM2在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用,在多种实体肿瘤中的表达异常,同时还有研究指出AIM2的表达能抑制人乳腺癌细胞、小鼠纤维母细胞等细胞的增殖。更好的了解AIM2的生物学功能及其相关机制可以帮助我们进一步寻找结直肠癌治疗方法。研究目的:本研究旨在了解AIM2在结直肠癌组织中的表达情况,以及探索其表达水平与患者相关临床病理特征之间的关系,同时研究AIM2的表达对于结直肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响并对其相关机制做初步探讨。材料与方法:1、收集外科手术切除的64例新鲜冰冻结直肠癌组织标本和相应的癌旁正常组织标本,利用荧光定量PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)技术检测AIM2在癌组织及相应癌旁正常组织中的表达,并分析其m RNA表达水平的差异;2、使用免疫组化技术检测68例手术切除的结直肠癌组织和相应癌旁正常组织的石蜡标本中AIM2的蛋白水平,分析AIM2在结直肠癌组织及相应癌旁正常组织中的蛋白表达情况,同时进一步分析AIM2的表达水平与患者临床病理因素之间的关系;3、构建含有AIM2基因的慢病毒载体,并使用慢病毒转染技术将AIM2基因转染至HCT-116结直肠癌细胞中,通过荧光定量PCR和Western Blotting技术验证AIM2在HCT-116结直肠癌细胞中是否稳定表达;4、利用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)染色、细胞凋亡实验、细胞周期实验和Transwell小室实验来分析AIM2对HCT-116结直肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响;5、选取AIM2转染和空载体转染的HCT-116结直肠癌细胞,并加入PI3K/AKT(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)传导通路的特异性激活剂IGF-1(Insulin-like Growth Factors,胰岛素样生长因子1),再通过Western Blotting技术检测结直肠癌细胞中p-AKT的水平,从而反映出PI3K/AKT通路的活性水平;6、激活AIM2转染和空载体转染的HCT-116结直肠癌细胞的PI3K/AKT通路后,使用细胞凋亡实验检测两组细胞的凋亡率,同时与未激活PI3K/AKT通路的HCT-116细胞相对比,探寻AIM2影响结直肠癌细胞凋亡的可能机制。研究结果:1、荧光定量PCR结果显示结直肠癌中AIM2的m RNA表达水平要显著低于正常组织(P<0.01);2、结直肠癌组织中AIM2蛋白的免疫反应评分和染色阳性率均要显著低于正常组织(P<0.01);3、结直肠癌组织中AIM2蛋白的免疫反应评分与肿瘤的分化等级密切相关,肿瘤分化程度越低,AIM2的蛋白水平越低,而与年龄、性别、肿瘤位置、T分期、淋巴结转移、远处转移及TNM分期等临床特征未见明显相关性;4、使用慢病毒转染技术可以将AIM2成功转染至HCT-116结直肠癌细胞中,荧光定量PCR和Western Blotting的结果显示,与空载体转染相比,AIM2载体转染的HCT-116细胞中,AIM2的m RNA及蛋白水平均有显著的上升(P<0.01);5、MTT实验结果显示,AIM2转染后的HCT-116结直肠癌细胞较空载体转染组相比,具有活性的细胞的数量显著减少(P<0.01),细胞生长显著减慢。这提示AIM2的表达可以抑制结直肠癌细胞的增殖;6、经过AIM2转染后的HCT-116结直肠癌细胞与空载体转染组相比,其凋亡率发生显著的下降(P<0.05);7、细胞周期实验的结果提示AIM2转染后的HCT-116结直肠癌细胞中处于S期的细胞比例下降,而处于G1和G2/M期的细胞比例则显著升高(P<0.05);8、Transwell小室实验提示AIM2的表达对于HCT-116结直肠癌细胞的侵袭能力未有明显影响;9、Western Blotting的结果显示未受到IGF-1激活的AIM2转染的细胞和空载细胞中p-AKT水平未见明显差异;而在接受IGF-1刺激后,两组细胞中p-AKT的表达水平均有显著升高,但是AIM2转染的HCT-116细胞中p-AKT的蛋白水平则要显著低于空载体对照组细胞中的p-AKT水平(P<0.01);10、经过IGF-1刺激后,AIM2转染的HCT-116细胞凋亡率要显著的低于对照组,这提示激活PI3K/AKT通路可以在抑制HCT116细胞的凋亡。结论:1、结直肠癌组织的AIM2表达水平出现显著的下降,并且肿瘤分化越差的患者肿瘤组织中AIM2的表达水平更低。2、AIM2的表达能显著的抑制结直肠癌细胞的增值活性,并在一定程度上促进细胞的凋亡,抑制细胞周期向S期的转化;3、AIM2可以抑制HCT-116细胞系中PI3K/AKT通路活性,而激活PI3K/AKT通路可以抑制HCT116细胞的凋亡。从而可推断出AIM2可通过抑制PI3K/AKT通路的活性从而发挥促进结直肠癌细胞凋亡的作用。