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大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，欧美国家肿瘤死亡原因统计中，大肠癌是仅次于肺癌的第二大原因，在我国已居第4—6位，并呈逐年上升的趋势。在过去20年中，虽然发展了多种不同的治疗措施来治疗大肠癌，但大肠癌患者的整体生存率并没有提高。因此，迫切需要寻找一种具有强大抗肿瘤作用且毒副作用小的治疗方法。 细胞凋亡机制的异常在大肠癌发生和抗肿瘤治疗中发挥重要作用，现有的研究提示很多抗肿瘤治疗是通过诱导肿瘤细胞的凋亡起作用。而基因治疗作为一种崭新的治疗方法，也正越来越引起人们的重视。 TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，是新近发现的介导细胞凋亡的信号分子，具有TNF家族成员的许多特性。TRAIL在许多组织中有表达，通过与其特异性受体的相互作用来发挥促凋亡作用。到目前为止，TRAIL一直被大多数人认为只诱导肿瘤细胞及转化细胞而不诱导正常细胞的凋亡。 使用腺病毒介导的基因转移，我们和其他研究者已经证明，在体内或体外直接把TRAIL基因转移到癌细胞中能够引起癌细胞的凋亡和肿瘤生长抑制；并且证实人类端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子能特异性地把促凋亡基因靶向到各种癌细胞中。本实验我们使用构建的以端粒酶启动子经GAL4间接表达GFP／TRAIL基因的腺病毒载体，对GFP／TRAIL基因在大肠癌细胞中的表达及抗人大肠癌细胞的活性和其浙江大学医学院2004届硕士学位论文对人类正常细胞的毒性进行了研究。实验材料和方法 实验材料细胞系:人胚肾细胞株293细胞、人大肠癌细胞株DLD一1、HT29和正常人骨髓成纤维细胞(BMFB)、正常人平滑肌细胞(NSMC);腺病毒载体:Ad爪TERT一gTRAIL、A山GT一TRAIL、A出PGK一GV 16、A山CMV一GFP;其它如细胞培养材料、倒置荧光显微镜、各种实验试剂、耗材和仪器等。 实验方法和步骤l)病毒扩增、纯化、鉴定和滴度测定:人胚肾细胞株293细胞扩增各重组腺病毒A的TERT一gTRAIL，Ad/GT一TRAIL，Ad/PGK一GV 16，Ad/CMV一GFP，用CsCI超速梯度离心法纯化，分光光度仪在260nm处测OD值换算得病毒滴度;2) TRAIL基因表达检测:3又10，个nLn一1、HT29、BMrB和NsMe细胞接种于六孔板，24hrs后以MOI(multiplieity of infeetion)值1000分别感染Ad爪TERT一gTRAIL，A山GT一TRAIL+Ad/PGK一GV 16，A出CMV一GFP和PBS(空白对照)，培养48hrs后，在荧光显微镜下观察细胞内荧光蛋白的表达和在流式细胞仪下直接检测GFP/TRAIL表达率。3)细胞生长曲线:将5只10，个oLo一l、HT29、BMrB和NsMe细胞分别接种于%孔板每孔，设立4个平行孔，接种后第24hrs后以MOI 1 000分别感染Ad小TERT一gTRAIL，A出GT一TRAxL+Ad/poK一GV16(阳性对照)，A山CMV一GFP(载体对照)和PBS(空白对照)，置于细胞培养箱培养;在感染后的第24hr，48hr，%hr，MTT法绘制细胞生长曲线:4)凋亡检测:6孔板每孔接种nLD一l、HT29、BMFB和NSMC细胞3 x 1 05个，接种24hrs后以Mol 1 000分别感染A的TERT一gT队IL，Ad/GT一TRAIL+Ad/PGK一GV16(阳性对照)，AdiCMV一GFP(阴性对照) 2 浙江大学医学院2004届硕士学位论文和PBS(空白对照)，每天用倒置显微镜观察细胞形态变化;感染48hrs后，收集细胞，用PI染色法在流式细胞仪上检测细胞凋亡率:5)实验数据用SPSS10.O进行统计，所得结果均进行配对T检验。结果与讨论 1.GFP/TRAIL基因表达结果:A的TERT一gTRAIL感染DLD一1、HT29细胞后，荧光显微镜下可见明显的绿色荧光蛋白的表达，流式细胞仪检测GFP/TRAIL表达率亦有41 .6%和31 .4%，而感染BMFB、NSMC细胞后却未见明显荧光蛋白表达，流式细胞仪检测GFP/TRAIL表达率为2.8%和4.6%。而CMV启动子驱动的GFP基因在DLD一1、HT29细胞、BMFB和NSMC中的表达率分别为54.1%、67.0%、28.0%和23.1%。提示CMV启动子驱动的GFP基因无论在肿瘤细胞和正常细胞中都有较高的表达。说明了端粒酶启动子对肿瘤细胞有着较高的特异性，并且，由其驱动的GFP/TRAIL基因能在肿瘤细胞内特异性表达。 2.GFP/T RAIL基因对大肠癌细胞和正常细胞生长的影响:MTT法检测结果显示，以PBS为空白对照，A的TERT一gTRAIL对DLD一1、HT29细胞的%hr生长抑制率分别达93.5%和742%，与PBS有非常显著差异(P<0.05)，而且其与阳性对照A出GT一TRAIL+Ad/PGK一GV16相近，说明端粒酶启动子驱动的TRAIL基因对DLD一1、HT29细胞的生长抑制作用是显著的，而A的TERT一gTRAIL对 BMFB、NsMc细胞的生长抑制率分别为8.1%、和10.9%，与PBS无显著差异(P>0.1)。我们认为端粒酶启动子驱动的GFP/T RAIL基因在对肿瘤细胞的杀伤作用和双载体系统的TRAIL基因是相近的，而对正常细胞无明显的生长抑制作用。 浙江大学医学院2004届硕士学位论文 3.GFP汀RAIL基因对大肠癌细胞的凋亡诱导作用:结果显示，A的TE盯一gT队IL作用DLn一l、HT29细胞48hrs后的凋亡率分别达41，1%和25.8%，与PBS有非常显著差异(P<0.05)，而且其与阳