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河北北部燕山南麓是我国桃树栽培的北限,该区域的桃树在自然越冬情况下不时遭受冬季低温危害。如果能够找出与桃树抗寒力密切相关的生理生化指标或分子标记,则在桃树抗寒育种中对抗寒性进行定向选择具有重要的参考价值。 本试验在以抗寒品种(‘久脆’桃)、不抗寒品种(‘21世纪’桃)为亲本进行杂交(正交、反交)并获得749株杂种后代的基础上,选择抗寒单株和不抗寒单株形成两组试验材料,于2012年-2014年自然越冬期间(进入休眠期、休眠期、解除休眠期)定期测定与抗寒可能相关的11个生理生化指标(含水量、相对电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量,游离脯氨酸含量、超氧化物歧化酶SOD活性、过氧化物酶POD活性、过氧化氢酶CAT活性、抗坏血酸含量、还原型谷胱甘肽含量),旨在找出与抗寒密切相关的生理生化指标,并克隆出与该指标性状相关的基因片段,为抗寒育种中的早期鉴定提供理论依据。试验结果如下: 1.桃枝条在自然越冬过程中,总含水量逐渐减少,但不抗寒植株的失水速率显著高于抗寒植株;桃枝条的束缚水/自由水比值逐渐增大。但是抗寒植株的束缚水/自由水(比值)明显高于不抗寒植株。 2.桃枝条在自然越冬过程中,随着温度的降低相对电导率越来越高,到冬季最低温时达到最高峰;温度逐渐回升时,相对电导率逐渐降低。但是抗寒植株相对电导率普遍低于不抗寒植株;与相对电导率的变化趋势相似,随着温度的降低丙二醛含量越来越高,到冬季最低温时达到最高峰,在此过程中抗寒植株丙二醛含量普遍低于不抗寒植株。 3.桃枝条在自然越冬过程中,随着温度的降低可溶性糖含量越来越高,到冬季最低温时达到最高峰;温度逐渐回升时,可溶性糖含量逐渐降低。但抗寒植株可溶性糖含量普遍高于不抗寒植株;可溶性蛋白质含量与可溶性糖含量变化趋势一致,随着温度的降低可溶性蛋白质含量越来越高,并且抗寒植株含量高于不抗寒植株;游离脯氨酸含量总体表现依时间逐渐升高的趋势。 4.桃枝条在冬季最低温时期SOD(超氧化物歧化酶)活性明显升高,而且抗寒植株的SOD活性高于不抗寒的植株;桃枝条在初冬温度下降过程中POD(过氧化物酶)活性显示一个高峰,在晚冬温度回升过程中CAT(过氧化氢酶)活性显示一个高峰,但抗寒植株与不抗植株间不具有规律性差异;抗氧化物质AsA(抗坏血酸)含量冬季最低温时期存在一个高峰,并且抗寒植株含量高于不抗寒植株;抗氧化物质GSH(还原型谷胱甘肽)含量在冬季最低温时抗寒植株含量高于不抗寒植株。 5.从11对引物中筛选出1对与Fe-SOD基因相关的特异性引物,并通过同源克隆得到了8个不同抗寒性桃品种(‘中华寿桃’、‘奉化玉露’桃、‘寿红’桃、‘莱山蜜’桃、‘21世纪’桃、‘瑞光27’桃、毛桃、‘珲春’桃)的Fe-SOD基因。 6.将8个抗寒性不同品种的扩增产物进行同源比对,同源性达91.47%,其中3个抗寒品种比5个不抗寒品种在997-1300bp处均缺失一段300bp左右的碱基序列。 7.抗寒品种(‘瑞光27’桃、毛桃、‘珲春’桃)的Fe-SOD基因同源性为99.83%,聚为一类;不抗寒品种(‘中华寿桃’、‘奉化玉露’桃、‘寿红’桃、‘莱山蜜’桃、‘21世纪’桃)的Fe-SOD基因同源性94.83%,聚为一类。 8.以抗寒品种‘瑞光27’桃和不抗寒品种‘莱山蜜’桃为例进行比较,发现不抗寒品种‘莱山蜜’桃的外显子在604bp-668bp处比抗寒品种‘瑞光27’桃的外显子相应位点长64个碱基;但在外显子末端少了10个碱基。 9.将抗寒品种‘瑞光27’桃和不抗寒品种‘莱山蜜’桃的Fe-SOD基因碱基序列分别翻译成氨基酸序列,其同源率达到94.43%,只是前者的氨基酸数目比后者少21个,其序列为ERFIEELRSAAATQFGSGWAW;在末端多了的氨基酸序列为LRS。 10.将抗寒品种‘瑞光27’桃和不抗寒品种‘莱山蜜’桃的Fe-SOD基因的5段内含子进行比对,一致性达69.98%,但有3处不同,不抗寒品种‘莱山蜜’桃的第2个内含子上多出236个碱基,第3个内含子上多出36个碱基,第5个内含子上少13个碱基。