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活性氧(ROS)在果实采后生防系统中发挥着重要的作用。在该系统中,寄主果实、病原菌、生物拮抗菌和环境因子构成了相互作用的四角关系。抑制病原菌致病力,增强生物拮抗菌生活力无疑是防治采后病害发生的关键措施。本研究以常见的采后病原真菌和酵母菌作为研究材料,探讨活性氧对真菌致病力的影响,以及酵母菌在多种环境逆境下活性氧的积累和其生活力的相互关系,并运用生物化学、蛋白质组学、分子生物学和显微荧光观察等研究方法,在全蛋白质组和线粒体亚细胞蛋白质组水平揭示活性氧对病原菌的调控机理,以及转录组水平探讨活性氧在逆境下的产生和积累对生物拮抗菌生活力的影响。
1.活性氧调控病原真菌致病力的机制:本论文重点研究了过氧化氢(H2O2)作为外源活性氧导致Penicilliumexpansum细胞死亡、致病力下降的分子机制。在病原真菌P.expansum的细胞全蛋白质组的差异表达谱中发现,对H2O2应答的蛋白主要与线粒体细胞器有关。通过线粒体亚细胞蛋白质组分析,鉴定出一些具有重要生理功能的蛋白,比如呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ,F1F0ATP合成酶以及线粒体磷酸载体蛋白等。通过荧光共定位和使用特异性抑制剂的研究表明呼吸链复合物Ⅲ是活性氧(ROS)作用的关键靶标蛋白,ROS的爆发引起线粒体蛋白的氧化损伤和膜透势耗散。同时,证实了ATP合成酶参与了氧化逆境的应答。这些研究结果说明氧化胁迫引起的线粒体特异蛋白损伤是导致P.expansum细胞死亡的重要原因,呼吸链复合物Ⅲ是ROS的作用靶标。
2.外源物质和热处理对病原真菌致病力的抑制机制:外源物质壳聚糖和硅酸钠处理对不同青霉菌(P.expansum;Penicilliumdigitatum)和灰霉(Botrytiscinerea)生长和致病力有明显的抑制作用。通过荧光显微观察发现,壳聚糖和硅酸钠对真菌致病力的抑制机理与质膜破坏,导致细胞内蛋白质和糖类等主要成分渗漏有关。壳聚糖对番茄果实青霉和灰霉病的防治效果还与诱导寄主抗性相关酶(多酚氧化酶PPO、过氧化物酶POD)活性以及酚类物质的增加有关。热水浸泡对采后桃果实褐腐病(Moniliafructicola)的抑制机理主要是引起了M.fructicola细胞内线粒体损伤、ROS积累和ATP下降,从而抑制病原菌的生长。同时热激处理还能诱导桃果实抗病相关基因的表达。
3.不同逆境对生物拮抗菌活性氧代谢的影响:生物拮抗菌在应用过程中会遇到各种环境逆境,导致细胞内产生大量的活性氧(ROS),从而影响其生活力。本论文研究了两种已经商业化了的生物拮抗菌Metschnikowiafructicola(商业产品名称‘Shemer’)和Candidaoleophila(商业产品名称‘Aspire’)对于氧化和高温逆境应答,结果发现氧化和高温逆境能诱发生物拮抗菌胞内活性氧大量积累,加剧蛋白氧化损伤,导致存活率下降。而前期亚致死高温(对M.fructicola)或氧化逆境(C.oleophila)的适应性处理可以明显增强生物拮抗菌对后续逆境的抗性及生防效力。亚致死高温能诱导M.fructicola海藻糖-6-磷酸合成酶基因的表达,增加抗逆性物质海藻糖的含量。利用差减杂交(SSH)建立了C.oleophila在亚致死氧化逆境下的差异表达文库,半定量RT-PCR证实了7个抗氧化基因对氧化逆境胁迫应答。
4.外源物质增强生物拮抗菌的抗氧化能力和生活力:首次发现甜菜碱能增强生物拮抗菌Cystofilobasidiuminfirmominiatum的抗氧化能力和生防效力。在生物拮抗菌Cryptococcuslaurentii和Pichiamembranaefaciens的液体剂型中加入了糖和抗坏血酸(Vc)作为保护剂,能够减轻活性氧的积累,增加生物拮抗菌的生活力和生防效力。