核酸修饰酶检测的新型生物传感器研究

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酶是一类生物催化剂。生命体内含有成千上百种蛋白质酶,它们的活性与生命体的生长、发育、新陈代谢等许多过程密切相关。大多数生命体由细胞构成,细胞的整个生命活动过程都有其体内的酶活性息息相关,只有保持酶的活性,细胞才能不断的发育和繁殖下去。当细胞中的酶失活性后,其生命过程也将结束。人类的许多生命体的疾病,很多都也与酶活性相关。因此,对生命体中重要酶的活性的检测以及其抑制剂的筛选很有研究意义。基于电化学分析法、化学发光分析法、荧光分析法,发展了一些低成本、简捷快速、具有特异的选择性和高灵度的生物传感器,检测人体内DNA核酸修饰酶活性。基于DNA甲基化敏感性限制性内切酶和末端转移酶的电化学生物传感器用于DNA甲基化转移酶活性的灵敏检测。主要内容包括:在第2章中,构建了一种灵敏的电化学传感器对DNA甲基化转移酶活性检测和对影响DNA甲基化转移酶活性作用的抑制剂筛选。本电化学DNA生物传感器基于甲基化敏感的限制性内切酶活性对特异性甲基化DNA序列的识别,利用末端转移酶的活性对末端碱基的延伸,从而达到对DNA甲基化转移酶活性的检测。该电化学生物传感器检测下限可达到0.04U/mL。在第3章中,设计了一条双链DNA探针,DNA糖基化酶hOGG1能特异性识别设计好的双链DNA,将受损的碱基8-oxo-dG从DNA序列中移除,产生一个新的5’磷酸端的缺口,由于缺口的产生,较短的DNA熔链温度变得低就会从互补链解链下来,形成具有新的5’磷酸端的双链DNA。由于Lambda外切酶能消化5’磷酸端的双链DNA,血红素核酸适体的互补链被消化分解释放出来,与血红素结合形成G四股螺旋结构的复合物,而这种复合物是具有辣根过氧化物酶的催化活性的DNAzyme,在有双氧水的情况下,将无色底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS2-)转化为绿色的ABTS-,这样就可以能通过极其简单的比色就能达到对hOGG1酶活性的检测。该方法的检测下限可达到0.01U/mL。在第4章中,基于Nick切刻酶等温循环和Mg2+的DNAymze切刻循放大环荧光信号用于DNA糖基化酶的灵敏检测。设计了一条DNA双链探针选择性识别hOGG1形成发夹结构,通过Nick酶切刻和DNA聚合酶作用于发夹结构。在常温条件下实现等温循环,产生大量Mg2+的DNAymze。体系中荧光淬灭的分子信标能被Mg2+的DNAymze水解,实现荧光增强,水解后Mg2+的DNAymze能够被解离,从而再作用其它分子信标达到循环作用。通过这两步循环的放大过程,分子信标荧光的恢复,从而达到对hOGG1酶活性的灵敏检测。该方法的检测下限可达到0.17U/mL。
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