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研究背景：组织移植是整形外科修复组织缺损的常用治疗手段。近年来,飞速发展的组织工程技术给组织修复带来了新的希望。组织工程化组织移植与自体组织移植类似,植入体内后同样存在一个血运重建的过程。然而,组织工程移植物血管化的速度通常非常缓慢,血管化不良已经成为组织工程发展的限制因素。研究表明,三维支架的使用有利于细胞形成管样结构和构建复合组织。人脂肪来源的间充质干细胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)可以沿着心血管方向分化且具有促血管形成特性。聚羟基乙酸(Polyglycolic acid, PGA)因其优越的性能在骨、软骨、肌腱等组织工程领域应用已久。hADSCs接种在聚乳酸(Polylactic acid, PLA)塑形后的PGA三维支架上是否有利于构建微血管化的工程组织尚未见报道。我们的研究可能为提高工程组织血管化效率,促进皮肤缺损和慢性创面的愈合带来新的契机。研究目的：1.评价hADSCs接种在PGA/PLA复合支架后定向分化为血管内皮细胞的潜能,探索将hADSCs-PGA/PLA复合物构建为微血管化的组织工程产物的可行性。2.探索hADSCs-PGA/PLA复合物的生物相容性。3.观察诱导后的hADSCs-PGA/PLA复合物对裸鼠皮肤缺损愈合情况的影响,为提高血管化效率以促进创面愈合提供实验依据。研究方法和结果：1.人脂肪间充质干细胞复合PGA/PLA支架后分化为内皮细胞能力的研究方法：取新鲜游离脂肪颗粒,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法对hADSCs进行分离和纯化。将hADSCs接种于PGA/PLA支架材料后,使用额外添加20ng/mL血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的成血管内皮细胞诱导培养基进行诱导培养,通过扫描电镜观察hADSCs在PGA/PLA支架材料上的贴附、生长与增殖情况。激光共聚焦显微镜观察细胞活性以及摄取乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素的能力,并于培养第7、14、21d进行免疫荧光染色观察细胞对CD31、vWF、VEGFR2、α-SMA的表达,同时提取细胞总RNA进行Real-time PCR检测VEGF、vWF、eNOS、α-SMA基因表达,综合评价hADSCs在PGA/PLA支架材料上定向诱导为血管内皮细胞的潜能。结果：hADSCs可以在PGA/PLA支架上良好地贴附、生长和增殖,并在诱导培养21d时获得血管内皮细胞特征性抗原标记,同时具有摄取乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素的能力,并且CD31、VEGFR2、vWF、eNOS基因表达在14d和21d均高于未诱导或者二维诱导的hADSCs (p< 0.05),而α-SMA的表达在细胞水平和mRNA水平均较低(p<0.05)。2.诱导后的人脂肪间充质干细胞-PGA/PLA复合物的体外免疫抑制作用方法：分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC),将成内皮细胞诱导培养的hADSCs-PGA/PLA (hADSCs-PGA/PLA诱导组)与PBMC体外共培养,3d后CFSE法观察PBMC的增殖情况,ELISA法检测炎性细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平,采用Transwell小室同时检测hADSCs-PGA/PLA诱导组与PBMC直接接触和间接接触时免疫抑制情况的差异。结果：PHA能刺激PBMC的增殖和对炎性因子的分泌。hADSCs-PGA/PLA诱导组与PBMC共培养不能刺激PBMC增殖,也不能使IFN-γ和IL-2分泌增加。相反,hADSCs-PGA/PLA诱导组能够显著抑制与PHA共培养的PBMC的增殖以及对IFN-γ和IL-2的分泌(p<0.05)。且细胞-细胞直接接触组抑制PBMC分泌IFN-γ和IL-2的能力大于间接接触组(p<0.05)3.诱导后的人脂肪间充质干细胞-PGA/PLA复合物修复皮肤缺损能力的研究方法：以BALB/c裸鼠为实验动物构建皮肤缺损模型,以覆盖成内皮细胞诱导培养的hADSCs-PGA/PLA和组织工程皮肤为治疗手段,选取7d、14d、21d三个时间点观察皮肤缺损愈合情况,同时进行透光实验、HE染色等判断血管新生情况,采用天狼星红染色、Masson染色观察新生皮肤组织胶原纤维的类型以及沉积和排列。为进一步探索诱导后hADSCs在新生血管形成中的作用和角色,我们采用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)慢病毒转染的]hADSCs接种部分PGA/PLA支架,植入体内21d取材切片CD31免疫荧光染色后进行示踪。结果：诱导后的hADSCs-PGA/PLA能显著加快皮肤创面修复速度,新生组织具有更丰富的血管,且胶原纤维的沉积和排列与正常皮肤组织无明显差异。同时,免疫荧光染色显示,支架上的hADSCs直接参与新生血管的组成。研究结论：1. PGA/PLA复合支架是一种生物相容性良好的可降解材料,hADSCs在PGA/PLA支架上可以良好的贴附、生长和增殖,在成内皮细胞诱导条件下,可分化为血管内皮细胞构建微血管化的组织工程产物。2.生长因子和PGA/PLA在诱导hADSCs获得成熟血管内皮细胞表型方面具有协同作用。3.诱导后的]hADSCs-PGA/PLA在体外具有低免疫原性和良好的免疫调节能力,且主要通过细胞-细胞直接接触发挥免疫抑制作用。4.向成血管内皮细胞方向诱导的hADSCs-PGA/PLA,可以促进新生血管形成,加快皮肤缺损愈合速度。