【摘 要】
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向日葵锈病（Puccinia helianthi）是向日葵生产上的重要病害,严重影响了向日葵的产量,并且给向日葵产业造成巨大的经济损失。课题组前期在对向日葵锈菌分泌蛋白进行筛选时,发现胞外分泌的金属蛋白酶基因Mep在夏孢子萌发时具有非常高的表达量,因此,我们推测该蛋白酶可能参与了向日葵锈菌的致病作用。本研究针对此金属蛋白酶,进行蛋白特性、结构分析,并构建了系统发育树。进一步利用筛选出的几种金属蛋白
【基金项目】
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国家自然科学基金（32060598）（32160642）； 内蒙古自然科学基金（ 2020MS03046）；
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向日葵锈病（Puccinia helianthi）是向日葵生产上的重要病害,严重影响了向日葵的产量,并且给向日葵产业造成巨大的经济损失。课题组前期在对向日葵锈菌分泌蛋白进行筛选时,发现胞外分泌的金属蛋白酶基因Mep在夏孢子萌发时具有非常高的表达量,因此,我们推测该蛋白酶可能参与了向日葵锈菌的致病作用。本研究针对此金属蛋白酶,进行蛋白特性、结构分析,并构建了系统发育树。进一步利用筛选出的几种金属蛋白酶抑制剂进行体外处理,验证该金属蛋白酶在向日葵锈菌致病中的作用。对Mep基因在锈菌侵染向日葵过程中的表达量进行了测定,研究结果为金属蛋白酶Mep致病机制的研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.通过建立系统发育树,发现金属蛋白酶与小麦条锈菌（Puccinia striiformis）的胞外金属蛋白酶有较高的同源性,并且与蛋白激酶有密切的关系。对其氨基酸序列的分析表明,该基因包含锌金属蛋白酶的HEXXH基序特征和真菌催化素M36肽酶结构域。三维结构分析表明,在催化活性区,发现有锌离子结合位点。推测该分泌蛋白属于金属蛋白酶。2.该胞外金属蛋白酶对偶氮酪蛋白具有水解活性,蛋白酶最适温度和p H分别是50℃和7.0,在p H5.0～9.0和温度50℃以下保持稳定。蛋白酶受到抑制剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、1,10-菲咯啉的显著抑制;Ca2+、Zn2+、Mg2+可以显著提高该蛋白酶的活性,进一步从酶学特性证明该酶为金属蛋白酶。3.利用q RT-PCR试验测定了基因Mep在锈菌侵染向日葵的过程中的表达情况,结果显示,在接菌48h时,基因表达量达到高峰,后逐渐降低,表明该蛋白酶参与了锈菌对向日葵的早期侵染过程。4.金属蛋白酶Mep的亚细胞定位显示其定位于烟草的细胞壁或细胞膜上。利用金属蛋白酶抑制剂处理向日葵叶片后,再接种锈菌,结果显示Mep处理的叶片发病明显早于对照,而且接菌10d后产孢量较对照增加,推测该金属蛋白酶参与了锈菌对向日葵的致病过程。
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