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目的:孤独症谱系障碍是一种神经发育疾病,特征为异常行为和社会语言功能的损伤[1]。孤独症谱系障碍患儿具有很高的精神共患病的发生率,例如学习障碍,ADHD,情绪障碍和慢性抽动障碍[2,3]。另外,孤独症谱系障碍的发生率为1/88[4]。孤独症谱系障碍男性的发生率是女性的5倍[5]。孤独症谱系障碍具有遗传背景[6],可被环境因素恶化,如饮食质量[7]和环境的化学物质[8]。如今,孤独症谱系障碍变成了一个主要的公共议题,许多的研究聚焦于此。然而,孤独症谱系障碍的深层病因尚不明确。氧化应激定义为:胞内活性氧升高和清除自由基的内源性抗氧化防护系统能力的降低导致的内环境失衡[9]。氧化应激促进血管和促炎分子的分泌[10],这些分子导致神经炎症[11]。此外,氧化应激牵涉一些精神疾病,如精神分裂症[12]和阿尔茨海默病[13]。氧化应激也与一些孤独症谱系障碍患者密切相关[14,15]。线粒体是胞内活性氧产生的主要来源,而胞内活性氧被认为是一种第二信使,参与了凋亡等生理过程[16]。在凋亡过程中,线粒体,细胞膜和胞质产生的多种细胞信号被激活[17]。此外,线粒体可感受到这些细胞信号,通过释放凋亡前因子进入胞质进而导致细胞凋亡,如Smac-DIABLO和细胞色素C（Cyto C）[18]。另外,线粒体氧化应激促进的凋亡与孤独症谱系障碍相关[19]。过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子1α（peroxisome proliferator activated receptor-γco-activator 1α,PGC-1α）是许多组织包括神经系统线粒体功能的主要调节因子[20]。过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）的活性可通过代谢生物传感器,沉默信息调节因子2相关酶1（sir2-related enzymes,sirtuins,SIRT1）交互作用而被NAD+依赖的去乙酰作用调节[21]。另外,PGC-1α激活转录因子,如核呼吸因子1（NRF1）和线粒体转录因子（TFAM）,进而产生线粒体呼吸蛋白[22]。然而,孤独症谱系障碍线粒体氧化应激中SIRT1/PGC-1α的作用尚不清楚。在本研究中,我们致力于确定孤独症谱系障碍类淋巴母细胞系（Class lymphoblasts cell line,LCLs）中SIRT1/PGC-1α信号的作用。首先,我们检测了孤独症谱系障碍患者和LCLs SIRT1-PGC-1α轴基因的表达。然后我们检测了孤独症谱系障碍LCLs胞内和线粒体胞内活性氧的产生和细胞凋亡。最后,我们检测了孤独症谱系障碍LCLs中过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对胞内活性氧产生和细胞凋亡的作用。我们首次证实过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）过表达可减轻孤独症谱系障碍LCLs的氧化损伤,过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）可以作为治疗的靶点。方法:1.参加者两组儿童参与了这项研究,每组包括35例6-12岁中国汉族男性儿童。孤独症组中患儿根据国际标准测试诊断为孤独症谱系障碍,该测试包括孤独症诊断性观察一览表中社会和语言方面（ADOS-G）[23],修订版孤独症诊断表三方面中的两个方面[24]。对照组为正常发育的健康儿童,与孤独症无关,无精神病（如精神分裂症）或基因疾病（如脆性X染色体综合征）。知情同意从参与者的法定监护人获得。该研究被安医附院伦理委员会批准。所有的参与者留取5ml全血作进一步研究。2.类淋巴母细胞系（LCLs）和细胞培养。选择至少1男性兄弟诊断孤独症谱系障碍的家系的10个儿童LCLs。10个年龄匹配的对照组LCLs来自于健康的男性捐献者,无神经或行为疾病病史。细胞在平均12代进行相关研究。因为在少代数时,遗传稳定性很高[25]。细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素（Invitrogen,USA）的RPMI 1640培养基,置于37度含5%CO2的孵育箱。3.细胞转染过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）过表达质粒,pCIG-PGC-1α,由GenePharma商业化构建,空白的pCIG载体作为对照。上述两种质粒用Lipofectamine 2000转染试剂根据说明书转染进孤独症谱系障碍LCLs。4.定量Real-Time PCR总RNA根据说明书用TRIzol（Invitrogen,USA）提取,用反转录SuperscriptII（Invitrogen,USA）反转录。定量Real-Time PCR在Agilent科技（Santa Clara,CA,USA）分析仪上应用SYBR Green PCR试剂（Roche,USA）实施。相对mRNA水平用2-ΔΔCtmethod法计算。5.Western Blot总蛋白提取物及线粒体游离胞质蛋白片段根据以前报道准备完善[26-27]。蛋白样本于SDS-PAGE胶上分离,然后转移到硝酸纤维素膜（Millipore）。膜上有抗-PGC-1α（1:2000;Santa Cruz Biotechnology,USA）,抗-TFAM（1:16000;Novus Bio,USA）,抗-NRF1（1:1000;Santa Cruz Biotechnology,USA）,抗-SIRT1（1:2000;Sigma-Aldrich）,抗-Cyto C（1:2000;eBioscience,San Diego,CA）,抗-DIABLO（1:1000;Cell Signaling Technologies,USA）and抗-GAPDH抗体（1:1000;Cell Signaling Technologies,USA）。印迹由化学发光检测分析（ECL,Amersham）。6.线粒体跨膜电位JC-1是一种荧光探针,对线粒体膜电位敏感（ΔΨm）[28]。当线粒体膜电位低时,JC-1不能聚集于线粒体基质,JC-1单体发出绿色荧光。当线粒体膜电位高时,JC-1聚集于线粒体基质,形成J剧集物产生红色荧光。红/绿比例的降低提示凋亡[29]。ΔΨm的变化用MitoProbe JC-1试剂盒（Invitrogen,USA）根据厂家说明书检测。由激光共聚焦扫描显微镜拍摄图像。在530nm激发/590nm发射下检测荧光。红/绿荧光比例用Image J软件分析。7.胞内活性氧和线粒体胞内活性氧含量测定DCFH-DA可被非特异性酯酶胞内分解,被胞内活性氧氧化而形成强荧光[30]。胞内活性氧水平可根据荧光DCFH-DA来确定。简单地说,细胞孵育在DCFH-DA（10μmol/L;Sigma-Aldrich）。DCFH-DA荧光强度用激光共聚焦显微镜确定（FV1200;Olympus,Tokyo,Japan）,在490nm激发/520nm放射下测定荧光。DCFH-DA平均荧光强度用Image J软件分析。线粒体胞内活性氧的产生用探针MitoSOX Red来测定。细胞孵育过夜使其粘附于盖玻片上。然后细胞37度孵育于2.5μM MitoSOX Red 30min。细胞用200 nM MitoTracker green处理15min以染线粒体。最后,细胞用激光共聚焦扫描显微镜（FV1200;Olympus,Tokyo,Japan）检测。510nm激发/585nm发射下检测荧光。Image J软件分析图像来确定AOD。8.复合物活性检测复合物I和III的活性根据既往报道检测[31]。20μg线粒体提取物用于NADH氧化检测中测定线粒体复合物I活性。线粒体复合物I用微平板免疫捕获。氧化还原染色和同时发生的NADH氧化为NAD+提示复合物I的活性。然后其活性在450nm下吸光度增强。为检测复合物III活性,需5 mg/ml线粒体提取物。由细胞色素C降低引起的复合物III活性在550nm处检测到吸光度增强。9.流式细胞术应用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡（Sigma,USA）。用FACSCalibur（Becton Dickinson）来分析。活（annexin-/PI-）,死亡（annexin-/PI+）,凋亡（annexin+/PI-）和晚期凋亡/坏死（annexin+/PI+）细胞根据既往报道方法描述[32]。结果:1.孤独症谱系障碍患者SIRT1-PGC-1α轴基因的表达结果显示SIRT1,PGC-1α,NRF1和TFAM mRNA在孤独症谱系障碍患者中显著减少。蛋白表达同样如此。结果提示在孤独症谱系障碍患者中,SIRT1/PGC-1α轴基因表达在转录和翻译水平降低。2.孤独症谱系障碍LCLs中SIRT1-PGC-1α轴基因表达和凋亡蛋白异位然后,我们检测了孤独症谱系障碍LCLs中SIRT1,PGC-1α,NRF1 and TFAM的表达。其表达在转录和翻译水平降低。在线粒体介导的凋亡中,线粒体外膜通透性增加,进而导致凋亡蛋白的释放。Cyto C和DIABLO从线粒体释放到胞质以适应凋亡。孤独症谱系障碍LCLs中Cyto C和DIABLO表达水平增高。结果证实孤独症谱系障碍LCLs中SIRT1/PGC-1α轴基因的表达下调,Cyto C和DIABLO从线粒体释放到胞质。3.孤独症谱系障碍LCLs中细胞凋亡孤独症谱系障碍LCLs中JC-1红/绿荧光比值较对照组降低。轻微的线粒体膜电位提示孤独症谱系障碍LCLs细胞凋亡的主要改变。孤独症谱系障碍LCLs凋亡增加（annexin+/PI-）,提示孤独症谱系障碍促进LCLs细胞凋亡。4.孤独症谱系障碍LCLs胞内胞内活性氧和线粒体胞内活性氧的产生凋亡产生过程中胞内活性氧产生增多。为检测孤独症谱系障碍LCLs胞内胞内活性氧和线粒体胞内活性氧,我们进行了DCFH-DA和MitoSOX Red染色。DCFH-DA是一种H2O2敏感的荧光探针,可用于胞内H2O2检测。MitoSOX Red是一种活细胞渗透染色试剂,可选择性和快速集中于线粒体,用于检测线粒体O2。孤独症谱系障碍LCLs被DCFH-DA染色的细胞显示胞内胞内活性氧产生增多。另外,为测定线粒体故氧化物,我们应用了MitoSOX Red。结果显示孤独症谱系障碍LCLs线粒体胞内活性氧增高。5.孤独症谱系障碍LCLs线粒体呼吸复合物的活性因胞内活性氧的过量产生损伤了呼吸链复合物的活性,我们检测了呼吸链复合物的活性,复合物I和III。结果显示孤独症谱系障碍LCLs复合物I和III活性降低。结果证实胞内活性氧导致孤独症谱系障碍LCLs线粒体呼吸链的损伤。6.过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对SIRT1-PGC-1α轴基因表达和凋亡蛋白异位的影响为研究过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对SIRT1,PGC-1α,NRF1和TFAM表达的影响,孤独症谱系障碍LCLs转染PGC-1α过表达载体和空白载体。过表达的过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）增加SIRT1,PGC-1α,NRF1和TFAM在转录和翻译水平的表达。另外,过表达的PGC-1α降低孤独症谱系障碍LCLs Cyto C和DIABLO的表达。结果显示过表达的过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）上调SIRT1/PGC-1α轴基因的表达,减少Cyto C和DIABLO的产生。7.过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对孤独症谱系障碍LCLs细胞凋亡的影响为检测PGC-1α对孤独症谱系障碍LCLs细胞凋亡的影响,JC-1染色用于测定ΔΨm的丢失。过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）过表达组线粒体膜电位明显增高。过表达的过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）抑制孤独症谱系障碍LCLs的细胞凋亡。相同的结果同样被annexin V/PI染色证实。8.过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对孤独症谱系障碍LCLs胞内胞内活性氧和线粒体胞内活性氧产生的影响。为检测过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对孤独症谱系障碍LCLs胞内胞内活性氧和线粒体胞内活性氧产生的影响,我们应用了DCFH-DA和MitoSOX Red染色。转染PGC-1α过表达载体的孤独症谱系障碍LCLs胞内胞内活性氧和线粒体胞内活性氧显著减少。9.过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对孤独症谱系障碍LCLs线粒体呼吸复合物活性的影响。然后,我们评估了过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）对孤独症谱系障碍LCLs线粒体呼吸复合物活性的影响,复合物I和III。结果显示过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）的过表达增加了孤独症谱系障碍LCLs复合物I和III的活性。结果还显示过氧化物酶增殖子激活的γ受体辅激活因子1α（PGC-1α）的过表达抑制孤独症谱系障碍LCLs胞内活性氧引起的线粒体呼吸链的损伤。结论:总之,我们证实线粒体氧化应激影响孤独症谱系障碍患儿,SIRT1/PGC-1α信号通路可能是孤独症谱系障碍医学治疗的靶点。